근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과
Summary
이 프로토콜의 근처-적외선 붙일 레이블된 DNA 젤 전기 이동 법 젤 이미지를 사용 하 여 변경 내용 관찰을 통해 수정 된 DNA의 DNA 중 합 효소 합성의 특성을 설명 합니다. 아크릴 아 미드 젤의 크기에 따라 다른 속도로 이동 하는 짧은 핵 산 분리의 고해상도 이미징에 사용 됩니다.
Abstract
어떤 효소에 대 한 강력 하 고, 양적 메서드는 네이티브와 조작 효소의 특성에 대 한 필요. DNA polymerases에 대 한 DNA 합성 생체 외에서 DNA 종합 분석 결과 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 뒤를 사용 하 여 특징 수 있습니다. 이 분석 결과의 목표 자연 DNA와 수정된 DNA (M-DNA)의 합성을 계량 하는 것입니다. 이러한 접근은 oligonucleotides 단일 뉴클레오티드 분해능, 효소 oligonucleotide 종합 동안 관찰의 개별 단계 사용을 해결 하는 데 특히 유용 합니다. 이러한 메서드는 생화학 및 생물 DNA 종합의 개별 단계, DNA 종합 그리고 DNA 바인딩 선호도의 오류율의 정상 속도 상수 측정 등 속성의 평가에 적용 되었습니다. 사용 하 여 구성 (NTP), M-DNA, 또는 돌연변이 DNA polymerases, 쌍을 효과적으로 평가 수 있는 기판-DNA 중 합 효소의 상대적 유틸리티 포함 하 되이 제한 되지 않고, 수정된 nucleoside 된 수정. 여기, 우리가 분석 결과 자체, 전례 없던 뇌관 DNA 라벨 근처-적외선 붙일 DNA 라는 등 전략에 맞게 만들 수 있어야 합니다 변경 내용을 포함 하 여 선발. 또한, 우리 쏟아져 아크릴 아 미드 젤에 대 한 중요 한 기술 단계 상세는 하 고 실행 하 고, 종종 수 있는 기술적으로 도전.
Introduction
DNA polymerases 정확 하 고 효율적인 DNA 합성을 수행 하 고 게놈 무결성을 유지 하기 위해 필수적입니다. 오류 없이 수백 초 당 뉴클레오티드를 합성 하는 능력 또한 분자 생물학 및 생명 공학에서 DNA polymerases 필수 도구를 만든다. 그러나, 이러한 속성은 또한 M-DNA 기판;에 대 한 응용 프로그램 제한 일반적으로 말하자면, 자연 DNA polymerases 수 없습니다 음성 합성 많은 잠재적으로 귀중 한 M-DNA 기판, 가능성이 인해 비표준 기판에 vivo에서를 사용 하 여에 대 한 높은 선택적 압력에. 많은 그룹 돌연변이 DNA polymerases M-DNA 합성1,2,3,,45;의 생성을 지시 진화 접근을 개발 했습니다. 이러한 노력은 DNA6,,78의 바이오 유틸리티를 확장 했습니다.
M-DNA 합성 돌연변이 DNA polymerases의 능력을 평가 하기 위해 우리9,10, 등11,,1213 일반적으로 사용 하는 DNA의 생체 외에서 측정 중 합 효소 활동이이 원고에 설명 되어 있습니다. 이 실험에서 DNA polymerases는 공동 incubated 레이블이 뇌관/템플릿을 이중와 nucleoside 3 인산 염 기판; 제품 젤 전기 이동 법에 의해 평가 됩니다. 특정 실험적인 질문, 돌연변이 DNA polymerases, 수정된 뇌관, 수정 된 서식 파일 또는 수정 된 nucleoside 된 사용할 수 있습니다, 활성화 돌연변이 효소 활동의 체계적인 생 화 확 적인 평가.
역사적으로, 이러한 분석 추적 DNA 합성; 5′ 방사성 라벨에 의존 가장 일반적으로, P 32 33P 사용 되었습니다; 일반적으로, 라벨 이루어집니다 T4 polynucleotide 키 니 아 제11를 사용 하 여. 그러나, 유한 수명 및 방사성 레이블 및 그들의 안전한 처리의 상대적으로 높은 비용, 우리의 그룹은 합성 5′ 근처-적외선 fluorophore DNA를 표시 대신 사용 합니다. 상대적으로 저렴 한 비용 근처-적외선 젤 영상을 사용 하 여, 우리는 비슷한 검출 한계가 방사성 레이블 (게시 되지 않은 결과)를 사용 하 여 이전 연구 관찰. 우리는 성공적으로 관측9, 과거 복제 하 고 우리가 하지 이전 측정된 속도 상수 (게시 되지 않은 결과)와 어떤 큰 양적 차이 관찰 했다.
DNA의 크기 및 따라서, DNA 종합의 정도 분석 하려면 우리는 생어 시퀀싱14 모 세관 전기 이동 법15의 도래 하기 전에 원래 개발 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 방법에 의존. 분리 또는 거리; 분자량의 측정으로 사용할 수 있습니다. 대형, 수직 polyacrylamide 젤 단일 뉴클레오티드 해상도, 다양 한 길이의 DNA oligonucleotides의 양적 관찰 가능 얻을 수 있습니다.
샨 다, 이러한 실험은 중 합 효소 특성에 대 한 강력한 방법입니다. 시간으로 인해 민감한 반응, 준비 및 관리의 재현성 결과 얻을 필요가 있다. 또한, 아크릴 아 미드 젤은 DNA 합성, 수많은 다른 DNA 수정 반응, 단일 뉴클레오티드 해상도 측정 하는 매우 효과적인 방법 그것은 기술적으로 도전 수 것 이다. 잘하면 여기 프로토콜 가장 일반적인 실수를 피하고 있는 동안이 실험을 수행 하려면 사용자가 하면 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 M-DNA의 DNA 중 합 효소 중재 합성 특성 분석 결과 설명 했습니다. 근처-적외선 레이블이 DNA 뇌관을 사용 하 여 다르게 크기 oligonucleotides 해결 하려면 변성 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 합성의 정확한 측정을 사용 oligonucleotides, 단일 뉴클레오티드 해상도 얻을 수 있습니다 우리. 이러한 접근 하거나 효소 (섹션 2.1)의 전반적인 활동을 측정 하거나 개별 단계 (다음 단계 2.1 참고…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 과학 발전 (Cottrell 대학 학술 상 #22548)에 대 한 연구 corporation 및 TriLink 바이오 (ResearchReward 그랜트 #G139)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
Riferimenti
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