用丙烯酰胺凝胶电泳法可视化近红外荧光标记 dna 聚合酶活性
Summary
本议定书描述了 dna 聚合酶合成的修饰 dna 通过观察的变化近红外荧光标记 dna 使用凝胶电泳和凝胶显像。丙烯酰胺凝胶用于高分辨率成像分离的短核酸, 这是根据大小不同的速率迁移。
Abstract
对于任何酶, 都需要有健壮的、定量的方法来表征本地和工程酶。对于 dna 聚合, dna 合成可以用一种体外dna 合成方法进行表征, 然后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法。该方法的目的是量化合成的天然 dna 和修饰 dna (M-dna)。这些方法是特别有用的解决单核苷酸分解寡核苷酸, 使观察的个别步骤在酶寡核苷酸合成。这些方法已被用于评价的一系列生物化学和生物物理特性, 如测量的稳态速率常数的个别步骤的 dna 合成, 错误率的 dna 合成, 和 dna 结合的亲和力。通过修改后的核苷 triphosphates (NTP)、m-dna 和/或突变的 dna 聚合, 可以有效地评价基质 dna 聚合酶对的相对效用。在这里, 我们详细的分析本身, 包括必须作出的改变, 以适应非传统的底漆 dna 标记策略, 如近红外线荧光标记 dna。此外, 我们有详细的关键技术步骤, 丙烯酰胺凝胶浇注和运行, 这往往是技术上的挑战。
Introduction
dna 聚合进行准确和有效的 dna 合成, 是维持基因组完整性的关键。在不出错的情况下, 每秒合成数百个核苷酸的能力也使 DNA 聚合了分子生物学和生物技术的基本工具。然而, 这些属性也限制了 M DNA 基板的应用;一般而言, 天然 dna 聚合不能合成许多潜在的有价值的 M dna 基质, 可能是由于对使用非标准基质的高选择性压力在体内。许多小组开发了有针对性的进化方法来产生突变的 dna 聚合能够进行 M dna 合成1a,2,3,4,5;这些努力扩大了 DNA 的生物技术效用6,7,8。
为了评估突变 dna 聚合合成 M dna 的能力, 我们9,10, 其他11,12,13通常使用体外测量 dna聚合酶活性, 这是在这篇手稿中描述。在这些实验中, DNA 聚合是 co-incubated 与标记的底漆/模板复式和核苷三磷酸基板;用凝胶电泳法对产品进行评价。根据具体的实验问题, 突变的 DNA 聚合, 改良引物, 改良的模板, 或改性的核苷 triphosphates 可以使用, 使突变酶活性的系统生化评价。
从历史上看, 这些化验都依赖于5的放射性标签来跟踪 DNA 合成;最常见的是, 使用了32p 和33p。通常, 使用 T4 核苷酸激酶11实现标记。然而, 由于放射性标签的寿命有限, 成本相对较高, 安全处置, 我们组改用合成5的近红外荧光标记 DNA。使用相对低成本的近红外凝胶成像仪, 我们观察到了使用放射性标签 (未发表的结果) 之前研究的类似检测限制。我们已经成功地重现了过去的观测值9, 我们没有观察到与以前测量的速率常数 (未发布的结果) 有任何大的定量差异。
为了分析 dna 的大小, 因此, 我们依靠聚丙烯酰胺凝胶电泳方法, 在毛细管电泳15问世之前为桑格测序14 。分离或移动的距离可以用作分子量的测量;大格式, 垂直聚丙烯酰胺凝胶可以实现单核苷酸的分辨率, 使定量观察的 DNA 寡核苷酸的长度不等。
总的来说, 这些实验是一种用于聚合酶表征的健壮方法。由于反应的时间敏感性, 准备和护理是必要的, 以达到重现的结果。此外, 虽然丙烯酰胺凝胶是一种非常有效的方法来测量 dna 合成, 以及许多其他的 dna 修饰反应, 单核苷酸分辨率, 它可以在技术上具有挑战性。这里的协议有望使用户能够执行这些实验, 同时避免最常见的错误。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了一种测定 dna 聚合酶介导的 M dna 的合成。利用近红外标记的 DNA 引物, 利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳解决不同大小的寡核苷酸, 可以获得核苷酸的单核苷酸分辨力, 从而实现对合成的精确测量。这些方法可以用来测量酶的整体活性 (2.1 节) 或测量单个步骤的蔑氏参数 (注意以下步骤 2.1)。我们的实验室最近使用这些来表征以前进化的酶9以及合理设计的酶<sup class="xr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了科学进步研究公司 (科特雷尔学院学者奖 #22548) 和三生物技术 (ResearchReward 赠款 #G139) 的支持。
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
Riferimenti
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