Summary

Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide

Published: October 06, 2017
doi:

Summary

Questo protocollo descrive la caratterizzazione della sintesi di DNA polimerasi di DNA modificato attraverso l’osservazione dei cambiamenti al DNA fluorescente contrassegnato vicino infrarosso mediante elettroforesi su gel e gel di imaging. Gel di acrilammide sono usati per l’imaging ad alta risoluzione della separazione degli acidi nucleici breve, che migrano a velocità diverse a seconda delle dimensioni.

Abstract

Per qualsiasi enzima, robusti, quantitativi metodi sono necessari per la caratterizzazione degli enzimi sia nativi che derivati dal. Per le polimerasi del DNA, sintesi del DNA possono essere caratterizzato usando un in vitro del DNA sintesi analisi seguito da elettroforesi in gel di poliacrilammide. L’obiettivo di questo test è quello di quantificare la sintesi di DNA naturale e di DNA modificato (M-DNA). Questi approcci sono particolarmente utili per la risoluzione dei oligonucleotides con risoluzione di singolo nucleotide, consentendo l’osservazione delle singole fasi durante la sintesi del oligonucleotide enzimatica. Questi metodi sono stati applicati per la valutazione di una matrice di proprietà biochimiche e biofisiche quali la misurazione delle costanti di tasso costante di singoli passaggi della sintesi del DNA, il tasso di errore della sintesi del DNA e affinità di legame del DNA. Utilizzando componenti tra cui, ma non limitatamente a, i trifosfati del nucleoside modificato (NTP), M-DNA, e/o mutante polimerasi del DNA, il relativo programma di utilità di substrato-DNA polimerasi coppie possono essere efficacemente valutate modificati. Qui, abbiamo dettaglio il dosaggio stesso, comprese le modifiche che devono essere fatte per ospitare contrassegno strategie quali DNA fluorescente contrassegnato vicino infrarosso del DNA primer non tradizionali. Inoltre, abbiamo dettagliate passi fondamentali tecnici per colata di gel di acrilammide e in esecuzione, che spesso può essere tecnicamente impegnativo.

Introduction

DNA polimerasi eseguire accurata ed efficiente sintesi di DNA e sono essenziali per mantenere l’integrità genomica. La capacità di sintetizzare centinaia di nucleotidi al secondo senza fare errori fa anche strumenti essenziali di DNA polimerasi in biologia molecolare e biotecnologie. Tuttavia, queste proprietà anche limitano le applicazioni per substrati M-DNA; in linea generale, naturale polimerasi del DNA non possono sintetizzare molti potenzialmente preziosi substrati di M-DNA, probabilmente dovuta alla alta pressione selettiva contro l’uso di substrati non standard in vivo. Molti gruppi hanno sviluppato approcci evoluzione diretto per generare la polimerasi del DNA mutante capace di M-DNA sintesi1a,2,3,4,5; questi sforzi hanno ampliato l’utilità biotecnologica del DNA6,7,8.

Per valutare la capacità della polimerasi del DNA mutante di sintetizzare M-DNA, abbiamo9,10e gli altri11,12,13 in genere utilizzano misurazioni in vitro del DNA attività della polimerasi, che sono descritte in questo manoscritto. In questi esperimenti, la polimerasi del DNA sono co-incubate con un primer con etichettato/modello duplex e nucleosidi trifosfato substrati; i prodotti sono valutati mediante elettroforesi in gel. A seconda della specifica domanda sperimentale, polimerasi del DNA mutante, modificate gli iniettori, modelli modificati, o trifosfati del nucleoside modificato possono essere utilizzato, consentendo la valutazione biochimica sistematica dell’attività dell’enzima mutante.

Storicamente, questi saggi hanno fatto affidamento su un’etichetta radioattiva 5′ per tenere traccia di sintesi del DNA; più comunemente, sono stati utilizzati 32P e 33P; tipicamente, etichettatura è realizzato utilizzando T4 polinucleotide chinasi11. Tuttavia, a causa della durata limitata nel tempo e il costo relativamente elevato di etichette radioattive e del loro smaltimento sicuro, il nostro gruppo utilizza invece un fluoroforo vicino infrarosso sintetico 5′ DNA contrassegnato. Utilizzando un costo relativamente basso vicino infrarosso gel imager, abbiamo osservato i limiti di rilevazione simile ai precedenti studi utilizzando etichette radioattive (dati non pubblicati). Abbiamo riprodotto con successo passato osservazioni9, e non abbiamo osservato alcuna grande differenza quantitativa con costanti di tasso precedentemente misurato (dati non pubblicati).

Per analizzare la dimensione del DNA e quindi, nella misura della sintesi del DNA, ci basiamo su metodi di elettroforesi del gel di poliacrilammide sviluppati originariamente per di sequenziamento Sanger14 prima dell’avvento di elettroforesi capillare15. La distanza di separazione o di mobilità può essere utilizzata come una misura di peso molecolare; grande formato, i gel di poliacrilammide verticali può raggiungere la risoluzione di singolo nucleotide, consentendo l’osservazione quantitativa di oligonucleotidi di DNA di lunghezza variabile.

Collettivamente, questi esperimenti sono un metodo affidabile per la caratterizzazione della polimerasi. A causa del tempo natura sensibile delle reazioni, la preparazione e la cura è necessaria per ottenere risultati riproducibili. Ulteriormente, mentre il gel dell’acrilamide è un modo molto efficace per misurare la sintesi del DNA, così come numerose altre reazioni modificazione di DNA, con risoluzione di singolo nucleotide, può essere tecnicamente difficile. Il protocollo qui speriamo che consentirà agli utenti di eseguire questi esperimenti, evitando gli errori più comuni.

Protocol

1. analisi di attività Nota: ci sono due tipi comuni di saggi che vengono spesso eseguiti per caratterizzare le polimerasi del DNA utilizzando i metodi descritti qui. Essi si differenziano se qualitativamente caratterizzano sintesi complessiva (che comprende numerosi passaggi della sintesi del DNA) o se essi si concentrano quantitativamente su singoli passaggi. Descriviamo qui di seguito i passi necessari per ognuno di questi. Nota: Poiché l’assemblaggio di materiali è relativamente c…

Representative Results

Un’analisi di successo del gel di poliacrilammide di una caratterizzazione qualitativa della attività complessiva (descritto nella sezione 2.1, Figura 1) e della cinetica allo stato stazionario (descritto nella nota in conclusione del punto 2.1, Figura 2) sono mostrati. Un’analisi di infruttuoso del gel di poliacrilammide è anche mostrata (Figura 3). <p class="jove_content" fo:keep-together.wit…

Discussion

Qui, abbiamo descritto un test per caratterizzare la sintesi di DNA polimerasi-mediata di M-DNA. Utilizzando primer di DNA con etichetta vicino infrarosso, e utilizzando l’elettroforesi del gel di poliacrilammide denaturante per risolvere diverse dimensioni oligonucleotidi, possiamo ottenere risoluzione di singolo nucleotide su oligonucleotidi, consentendo la misurazione precisa di sintesi. Questi approcci possono essere usati per misurare l’attività complessiva dell’enzima (sezione 2.1) o per misurare i parametri di Mi…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da Research Corporation per l’avanzamento scientifico (Cottrell College Scholar Award n. 22548) e da TriLink Biotechnologies (ResearchReward Grant #G139).

Materials

Tris HCl Promega H5123
Tris Base Promega H5131
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
Acetylated BSA Promega PR-R3961
KCl Sigma P4504
Dithiothreitol (i.e. DTT) Research Products International D11000
Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) Sigma 03690-100mL
Glycerol Sigma G5516
Formamide Acros AC42374-5000
Orange G Sigma Aldrich O3756
Bromophenol blue Fisher Scientific 50-701-6973
dNTPs Fisher Scientific FERR0191
M-dNTPs (riboNTPs) Fisher Scientific 45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTPs (all other modified NTPs) TriLink Biotechnologies assorted
primer 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA
template 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA
Acrylamide Research Products International A11405 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide
Tris/Borate/EDTA (TBE) solid Research Products International T22020
Urea ultrapure Research Products International U20200
Gel tape CBS Scientific GT-72-10
Large white spring clamp polypropylene CBS Scientific GPC-0001
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific BP179
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Fisher Scientific BP15020
0.75 mm spacers CBS Scientific SGS-20-0740A
33×42 Notched Glass Plate Set CBS Scientific SGP33-040A
Wedge plate separator CBS Scientific WPS-100
Comb for gel electrophoresis CBS Scientific SG33-0734
Gel electrophoresis rig CBS Scientific SG-400-33
ultrapure water we use a Milli-Q system from Millipore
DNA polymerases we prepare these in our laboratory using published protocols.

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Lewis, E. L., Leconte, A. M. DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (128), e56228, doi:10.3791/56228 (2017).

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