Summary

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, latéral Septal Nucleus- et le striatum spécifique<em> In Utero</em> L'électroporation dans la souris C57BL / 6

Published: January 18, 2016
doi:

Summary

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Abstract

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.

Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Introduction

Depuis la première description en 2001 par trois groupes indépendants 1-3 i n utero électroporation est devenu un outil standard largement utilisé pour l'analyse de l'expression des gènes dans le système nerveux central des rongeurs. Par rapport à la génération de souris knock-out, ce qui est, en dépit de l'amélioration continue des techniques, encore temps et d'argent, de consommer les électroporation in utero appels en raison de sa simplicité. Donc, in utero électroporation permet intensité forte rapide et efficace et des études de perte de fonction 4.

Pour transfecter les régions cérébrales, la solution contenant le plasmide chargé négativement est injecté dans un ventricule. Pendant l'impulsion électrique, l'ADN chargé négativement migre vers le pôle positif et, par conséquent la région transfectée peut être sélectionnée simplement en modifiant la position du pôle positif. Il a été démontré fréquemment que de nombreuses régions du système nerveux central peuvent être targeted 3,5-8. Par exemple, des études récentes montrent transfections spécifiques de l'hippocampe, le cortex piriforme ou le striatum 11/09. Cependant, les informations sur les positions appropriées ne sont souvent guère normalisée et ne sont pas toujours faciles à transférer à différentes souches de souris.

Transfection de certaines étapes embryonnaires est loin d'être anodin. De nombreux facteurs influencent doivent être prises en considération lors du choix du set-up pour spécifique électroporation in utero. Tout d'abord, pour la transfection de manière optimale les stades embryonnaires respectifs, les connaissances sur les tensions appropriées est nécessaire. Des tensions élevées diminuent le taux de survie, alors que de faibles tensions réduisent la 2,3,12 de l'efficacité de transfection. Également la taille de la palette de l'électrode joue un rôle crucial, car l'utilisation de palettes d'électrodes qui sont trop grands résultats dans la spécificité réduite ou peuvent causer la mort en raison de l'affection du rythme cardiaque 4,12,13. La appliquéla tension et la taille et la position de la palette d'électrode sont les caractéristiques les plus importantes à considérer, mais il ya aussi d'autres facteurs qui influent sur le résultat de l'électroporation, comme la quantité appliquée de l'ADN-solution.

Nous avons développé un protocole détaillé qui permet transfection rapide et efficace des diverses régions cérébrales de la souris C57BL / 6 12. Dans ce protocole, des informations détaillées sur les tensions à être utilisé et la taille de la palette d'électrode pour une spécificité accrue est fourni. En outre, des informations sur le ventricule à être rempli avec des recommandations pour la quantité de solution de plasmide et la position de l'électrode est fournie. L'indication de l'information de position dans un plan détaillé et la poursuite de la visualisation de ces positions permet spécifique simple et efficace de l'électroporation in utero du cortex rétrosplénial, le cortex moteur, le cortex somatosensoriel, le cortex piriforme, til corne d'Ammon 1-3, le gyrus denté, le striatum, le noyau septal latéral, le thalamus et l'hypothalamus.

Protocol

Déclaration d'éthique: La manipulation de la souris et les procédures expérimentales ont été menées en conformité avec les directives européennes, nationales et institutionnelles pour les soins aux animaux. 1. électroporation in utero Remarque: In utero électroporation a été réalisée comme précédemment publiée 12,14. Par conséquent, le procédé est seulement brièvement décrit ci-après (figure …

Representative Results

Figure 2, montre des exemples pour le spécifique in utero électroporation des régions en développement dans le cortex rétrosplénial, le cortex moteur, le cortex somatosensoriel, le cortex piriforme, la corne d'Ammon 1-3, le gyrus denté, le striatum, le noyau septal latéral , le thalamus et l'hypothalamus. Les résultats des transfections sont présentés à côté de l'angle recommandé (Figure 2). Pour une meilleure visualisation des angles in vivo…

Discussion

This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Technical supported by Melanie Pfeifer and Nikolai Schmarowski (Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz).

Materials

EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
Fast Green Roth 0301.1
pCAGGS Addgene
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) Wold Precision Instrument Inc. 1B100F-4
Isoflurane (Forene) Abbott PZN 4831850
Carprofen (Rimadyl) Pfizer GmbH approval number: 400684.00.00
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) Bayer  PZN 01578681
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution Pharmacy
of the University Medical Center Mainz
gauze (ES-Kompressen) Hartmann 407835
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture Ethicon Johnson & Johnson K890H
ring forceps 1/ 1.5 mm Fine Science Tools 11101-09
ring forceps 4.8/ 6 mm Fine Science Tools 11106-09
ring forceps 2.2/ 3 mm Fine Science Tools 11103-09
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm Fine Science Tools 1106-12
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm Fine Science Tools 14028-10
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm Fine Science Tools 14012-15
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11251-20
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm Fine Science Tools 12565-14
Elektroporator CUY21 SC  Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead Sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Microgrinder EG-44 Narishige
P-97 Micropette Puller Sutter Instrument Company P-97
Platinum electrodes 650P 0.5 mm Nepagene CUY650P0.5
Platinum electrodes 650P 3 mm Nepagene CUY650P3
Platinum electrodes 650P 5 mm Nepagene CUY650P5
Platinum electrodes 650P 10 mm Nepagene CUY650P10
Anesthesia system Rothacher-Medical GmbH CV-30511-3 Vapor 19.3
Heating plate Rothacher-Medical GmbH HP-1M
Temperature Controller 220V AC Rothacher-Medical GmbH TCAT-2LV

Riferimenti

  1. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  2. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  3. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103 (4), 865-872 (2001).
  4. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (July), i120-i125 (1991).
  5. Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).
  6. Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).
  7. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
  8. Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. FNMOL. 4 (November), 37 (2011).
  9. Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development. Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).
  10. Niwa, M., Kamiya, A., et al. Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits. Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).
  11. Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes. Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).
  12. Baumgart, J., Grebe, N. C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system. J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).
  13. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  14. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. JoVE. (54), (2011).
  15. Guedel, A. E. . Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , (1937).
  16. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
  17. Mizutani, K., Saito, T. Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex. Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).
  18. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).

Play Video

Citazione di questo articolo
Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J. Vis. Exp. (107), e53303, doi:10.3791/53303 (2016).

View Video