Cortex-، Hippocampus-، Thalamus-، Hypothalamus-، الجانبي الحاجزي Nucleus- والمخطط محددة<em> في الرحم</em> Electroporation للفي C57BL / 6 الماوس
Summary
This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.
Abstract
In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.
Introduction
منذ أول وصف في عام 2001 من قبل ثلاث مجموعات مستقلة 1-3 ط ن الرحم Electroporation للأصبحت أداة القياسية المستخدمة على نطاق واسع لتحليل التعبير الجيني في النظام العصبي المركزي القوارض. بالمقارنة مع جيل من الفئران خروج المغلوب، الذي هو، على الرغم من تحسن مستمر التقنيات، لا يزال الوقت والمال المستهلكة، والرحم في الطعون Electroporation للبسبب بساطته. لذلك، في الرحم Electroporation للتمكن gain- بسرعة وكفاءة والخسارة من وظيفة الدراسات 4.
ل transfect المناطق الدماغية، يتم حقن محلول يحتوي على البلازميد سالبة الشحنة إلى البطين. خلال النبض الكهربائي، والحمض النووي سالبة الشحنة بترحيل نحو القطب الموجب، وبالتالي يمكن تحديد المنطقة transfected ببساطة عن طريق تغيير موقف القطب الموجب. وكثيرا ما تبين أن العديد من مناطق الجهاز العصبي المركزي يمكن أن يكون تاrgeted 3،5-8. على سبيل المثال، تظهر الدراسات الحديثة transfections محدد من الحصين والقشرة الكمثرية أو المخطط 11/09. ومع ذلك، فإن المعلومات حول المواقف المناسبة غالبا ما تكون موحدة بالكاد فقط وليست دائما سهلة لنقل لسلالات مختلفة الماوس.
ترنسفكأيشن بعض المراحل الجنينية لا يزال بعيدا عن تافهة. يجب أن تؤخذ العديد من العوامل التي تؤثر في الاعتبار عند اختيار مجموعة المتابعة لتحديدا في الرحم Electroporation لل. أولا، ل transfect على النحو الأمثل المراحل الجنينية منها، هناك حاجة إلى معرفة الفولتية المناسبة. الفولتية العالية تقلل من معدل البقاء على قيد الحياة، في حين الفولتية المنخفضة تقلل من 2،3،12 كفاءة ترنسفكأيشن. أيضا حجم مجداف الكهربائي يلعب دورا حاسما، لأن استخدام المجاذيف الكهربائي التي هي نتائج كبيرة جدا في خفض خصوصية أو يمكن أن يسبب الوفاة بسبب المودة من ضربات القلب 4،12،13. وتطبقالجهد وحجم وموقف مجداف الكهربائي هي أهم سمات للنظر، ولكن هناك أيضا عوامل أخرى تؤثر على نتائج Electroporation لل، مثل كمية التطبيقية من الحمض النووي الحل.
قمنا بتطوير بروتوكول مفصلة والتي تمكن ترنسفكأيشن سريعة وفعالة من مختلف المناطق الدماغية من الفأرة 12 C57BL / 6. في هذا البروتوكول على معلومات مفصلة حول الفولتية لاستخدامها ويتم توفير حجم مجداف الكهربائي لتعزيز خصوصية. وعلاوة على ذلك، معلومات عن البطين المراد شغلها جنبا إلى جنب مع ويتم تزويد توصيات لكمية من محلول البلازميد وموقف القطب. في إشارة إلى معلومات الموقع مفصلة في خريطة والتصور مزيد من هذه المواقف يمكن محددة واضحة وفعالة في الرحم Electroporation للمن القشرة خلف الطحال، والقشرة الحركية، والقشرة الحسية الجسدية، والقشرة الكمثرية، رانه قرن آمون 1-3، والتلفيف المسنن، المخطط، نواة الحاجز الأفقي، والمهاد وتحت المهاد.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Technical supported by Melanie Pfeifer and Nikolai Schmarowski (Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz).
Materials
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fast Green | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
| eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| 0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
| gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
| ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
| FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
| Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
Riferimenti
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (July), i120-i125 (1991).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).
- Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. FNMOL. 4 (November), 37 (2011).
- Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development. Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).
- Niwa, M., Kamiya, A., et al. Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits. Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).
- Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes. Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).
- Baumgart, J., Grebe, N. C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system. J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. JoVE. (54), (2011).
- Guedel, A. E. . Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , (1937).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
- Mizutani, K., Saito, T. Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex. Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
