Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Боковые перегородки ядерно и Стриатум конкретных<em> В утробе матери</em> Электропорация в C57BL / 6 мыши
Summary
This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.
Abstract
In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.
Introduction
С первого описания в 2001 году тремя независимыми группами 1-3 я н маточно электропорации стала широко используется стандартный инструмент для анализа экспрессии генов в грызунов центральной нервной системы. По сравнению с поколением мышей с, что, несмотря на постоянно улучшающих методов, до сих пор времени и денег отнимает, то в утробе электропорации призывы из-за своей простоты. Так, в период внутриутробного развития электропорации позволяет быстро и эффективно амплитудно и с потерей функции исследования 4.
Для трансфекции церебральных областей, раствор, содержащий отрицательно заряженный плазмиду вводят в желудочек. Во электрического импульса, отрицательно заряженный ДНК мигрирует к положительному полюсу и, следовательно, трансфицировали область может быть выбрана просто изменения положения к положительному полюсу. Это часто было показано, что многочисленные участки центральной нервной системы может быть таrgeted 3,5-8. Например, недавние исследования показывают, конкретные трансфекций гиппокампа, в грушевидной коре или стриатуме 9-11. Тем не менее, информация о соответствующих положениях, часто только едва стандартизированы и не всегда легко передать различных штаммов мыши.
Трансфекция некоторых эмбриональных стадиях далеко не тривиальна. Многие влияющие факторы должны быть приняты во внимание при выборе настройки для конкретных внутриутробно электропорации. Во-первых, оптимально трансфекции соответствующих эмбриональной стадии, знание о соответствующих напряжений необходим. Высокое напряжение уменьшить выживаемость, в то время как низкие напряжения уменьшают 2,3,12 эффективности трансфекции. Также размер электрода веслом играет решающую роль, так как использование электродов весла, которые слишком большие приводит к снижению специфичности или может повлечь за собой смерть из-за поражения сердечного ритма 4,12,13. Применяемаянапряжение и размер и положение электрода весла являются наиболее важные особенности, которые следует учитывать, но есть также дополнительные факторы, влияющие на исход электропорации, как прикладной количества ДНК-раствора.
Мы разработали подробный протокол, который позволяет быстро и эффективно трансфекции различных церебральных областей C57BL / 6 мыши 12. В этом протоколе подробная информация о напряжениях, которые будут использоваться и размер электрода лопастью для повышения специфичности обеспечивается. Кроме того, информация о желудочке быть заполнены а также рекомендации по количеству раствора плазмиды, и положением электрода подается. Индикация подробной информации позиции в карте и дальнейшего визуализации этих позиций позволяет простой и эффективный специфический внутриутробно электропорации ретроспленальной коры, в моторной коре, соматосенсорной коре, в грушевидной коре, тон Корню ammonis 1-3, зубчатой извилине, полосатое тело, боковая перегородки ядро, таламус и гипоталамус.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Technical supported by Melanie Pfeifer and Nikolai Schmarowski (Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz).
Materials
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fast Green | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
| eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| 0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
| gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
| ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
| FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
| Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
Riferimenti
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (July), i120-i125 (1991).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).
- Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. FNMOL. 4 (November), 37 (2011).
- Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development. Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).
- Niwa, M., Kamiya, A., et al. Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits. Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).
- Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes. Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).
- Baumgart, J., Grebe, N. C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system. J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. JoVE. (54), (2011).
- Guedel, A. E. . Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , (1937).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
- Mizutani, K., Saito, T. Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex. Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
