Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי<em> ברחם</em> Electroporation בC57BL / 6 העכבר
Summary
This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.
Abstract
In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.
Introduction
מאז התיאור הראשון בשנת 2001 על ידי שלוש קבוצות עצמאיות 1-3 אני n electroporation ברחם הפך לכלי סטנדרטי בשימוש נרחב לניתוח ביטוי גנים במערכת העצבים המרכזית של המכרסמים. בהשוואה לדור של עכברי נוקאאוט, שהוא, למרות טכניקות שיפור ברציפות, עדיין זמן וכסף רב, ברחם הערעורים electroporation בשל הפשטות שלה. אז, ברחם electroporation מאפשר gain- מהיר ויעיל ומחקרי הפסד של פונקציה 4.
לtransfect האזורים במוח, התמיסה המכילה את הפלסמיד הטעון השלילי מוזרקת לתוך חדר. במהלך הדופק החשמלי, ה- DNA הטעון השלילי נודד לכיוון הקוטב החיובי ולכן אזור transfected ניתן לבחור פשוט על ידי שינוי המיקום של הקוטב החיובי. זה לעתים קרובות הוכח כי אזורים רבים של מערכת העצבים המרכזית יכולים להיות ת"אrgeted 3,5-8. לדוגמא, המחקרים האחרונים מראים transfections הספציפי של ההיפוקמפוס, קליפת אגסי או סטריאטום 9-11. עם זאת, המידע על העמדות המתאימות הם לעתים קרובות טופל רק בקושי והם לא תמיד קלים להעביר לזנים שונים עכבר.
Transfection של שלבים עובריים מסוימים הוא רחוק מכך. גורמים המשפיעים על רבים חייבים להילקח בחשבון בעת בחירת ההגדרה לספציפי electroporation ברחם. ראשית, כדי transfect אופטימלי השלבים עובריים המתאימים, יש צורך בידע על המתח המתאים. מתח גבוה להקטין את שיעור ההישרדות, ואילו מתח נמוך להפחית את יעילות transfection 2,3,12. גם הגודל של ההנעה אלקטרודה ממלא תפקיד מכריע, משום שהשימוש במשוטי אלקטרודה שתוצאות גדולות מדי בסגוליות מופחתות או יכול לגרום למוות בשל חיבה של קצב הלב 4,12,13. מיושםמתח ואת הגודל והמיקום של ההנעה אלקטרודה הם התכונות החשובות ביותר שיש לשקול, אבל יש גם גורמים נוספים המשפיעים על התוצאה של electroporation, כמו הכמות השימושית של ה- DNA-פתרון.
פיתחנו פרוטוקול מפורט המאפשר transfection המהיר והיעיל של אזורי מוח השונים של עכבר C57BL / 6 12. בפרוטוקול זה מידע מפורט על המתח כדי לשמש ואת הגודל של ההנעה אלקטרודה לסגולית משופרים מסופק. יתר על כן, מידע על החדר להיות מלא יחד עם המלצות לסכום של פתרון פלסמיד ואת המיקום של האלקטרודה מסופקת. אינדיקציה למידע מיקום מפורט במפה והדמיה נוספת של עמדות אלה מאפשרת ספציפיים פשוטים ויעילים ברחם electroporation של קליפת retrosplenial, הקורטקס המוטורי, הקליפה החושית, קליפת אגסי לא,הוא קורנו ammonis 1-3, gyrus המשונן, סטריאטום, הגרעין במחיצה לרוחב, התלמוס וההיפותלמוס.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Technical supported by Melanie Pfeifer and Nikolai Schmarowski (Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz).
Materials
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fast Green | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
| eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| 0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
| gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
| ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
| FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
| Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
Riferimenti
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 (July), i120-i125 (1991).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).
- Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. FNMOL. 4 (November), 37 (2011).
- Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development. Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).
- Niwa, M., Kamiya, A., et al. Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits. Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).
- Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes. Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).
- Baumgart, J., Grebe, N. C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system. J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. JoVE. (54), (2011).
- Guedel, A. E. . Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , (1937).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
- Mizutani, K., Saito, T. Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex. Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
