Долгосрочная Хронический<em> Синегнойной палочки</em> Дыхательных инфекции у мышей
Summary
Мы опишем метод агар-бусы установить постоянный долгосрочный хронический синегнойной палочки инфекции дыхательных путей в модели мыши.
Abstract
Мышиная модель хронической инфекции дыхательных путей является ключевым активом в Муковисцидоз (МВ) исследования, хотя есть ряд проблем, касающихся самой модели. Ранние фазы воспаления и инфекции широко изучаются с помощью модели агар-бусы мыши синегнойной палочки, а только несколько сообщений были направлены на долгосрочной хронической инфекции в естественных условиях. Основная задача для долгосрочного хронической инфекции остается низкое содержание бактерий бремя по P. палочки и низкий процент инфицированных мышей недель после заражения, указывая, что бактериальные клетки постепенно очищается хозяина.
Эта статья представляет собой способ получения эффективного долгосрочного хронической инфекции у мышей. Этот метод основан на вложении P. палочки клинические штаммы в агар-бисером в пробирке, а затем введение в трахею у мышей C57Bl/6NCrl. Двустороннее инфекция легких связано с нескольEral измеримые читать-аутов в том числе потери веса, смертности, хронической инфекции и воспалительной реакции. П. клиническая штамм палочки RP73 было предпочтительнее, чем лабораторного штамма отсчета PAO1, так как это привело к сравнительно низкой смертности, более тяжелых поражений и высшего хронической инфекции. П. палочки колонизация может сохраняться в легких в течение трех месяцев. Мышиные патология легких напоминает больных МВ с распространенным хроническим легочным заболеванием.
Эта модель мышиной наиболее близко имитирует ход болезни человека и может быть использован как для исследований патогенеза и для оценки новых методов лечения.
Introduction
Муковисцидоз (МВ) является генетическим заболеванием, вызывается мутациями в кистозный фиброз трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) гена. Этот ген кодирует для канала хлорида экспрессируется на мембране большинства эпителиальных клеток. Бронхоэктазы, слизь закупорка и паренхимы Разрушения, вызванные, главным образом, синегнойной палочки инфекций постепенно привести к тяжелым заболеванием легких и смертности в большинстве пациентов с МВ 1. Понимание патогенеза CF и дальнейшее развитие новых методов лечения полагаться на животной модели с характерными особенностями CF. Несколько мышей, генетически модифицированные для гена CFTR, были получены, но ограничения в способности этих видов резюмировать МВ-подобного заболевания легких и несколько других отклонений органов видели у пациентов с МВ были широко документированы 2.
Развитие инфекции является одним из основных проблем в CF животной модели. Литературные клрано предполагает, что хронические инфекции продолжительностью более одного месяца может быть достигнуто только, если мышам инокулировали бактерий, внедренных в иммобилизирующей агентом, таким как агар, агароза, альгинат или водорослей 3-5. Эти смирительные агенты обеспечивают микроаэробных / анаэробные условия, которые позволяют бактериям расти в виде микроколоний, аналогично росту в слизи у пациентов с МВ 6. Эта модель хронической инфекции приводит к персистенции бактерий в легких, вызывая воспаление дыхательных путей и повреждение 7. Однако, в зависимости от используемого метода, бактериального штамма и дозы инокулированных в легких, процент хронических инфицированных мышей и бактериальная нагрузка восстановлены в легких в различные моменты времени могут значительно отличаться. В частности, основной задачей для долгосрочного хронической инфекции остается низкое содержание бактерий бремя по P. палочки и низкий процент зараженных мышей недель после заражения, что свидетельствует тхат бактериальные клетки постепенно очищается хозяина. Выбрав P. палочки RP73 клиническая штамм из коллекции CF изолирует 8 мы успешно получили низкую смертность, более серьезные повреждения, и высокий процент хронической инфекции со стабильным бактериальной нагрузки до одного месяца у мышей C57Bl/6NCrl.
Эта статья детализирует методологию внедрения P. палочки в чашках с бисером; мы заразили мышей на введение в трахею, измеряется бактериальной нагрузки и цитокины в легких, собранные БАЛ и выполняется гистологическое исследование. В целом, этот протокол будет помочь исследователям в решении принципиально важных вопросов о патогенезе 8,9 и тестирования новых методов лечения против P. палочки хроническая инфекция 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в P. подготовка палочки-шарики и вызов мыши представлены ниже.
Палочки штамма П. используется для мышей вызов имеет решающее значение. Смертность, хроническая инфекция или зазор может значительно отличаться в зависимости от бактериа?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в лаборатории Bragonzi была финансируется итальянской Муковисцидоз Фонда (CFaCore) и ЕС-F7-2009-223670. Часть этой работы была проведена в перегонный куб, передовые лаборатории микроскопии и мышь гистопатология была выполнена в блоке патологической анатомии (Сан-Раффаэле Научно институт).
Materials
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml syringe 25 G 5/8'' 0.5 x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22GA 0.9 x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% neutral buffered formalin | Bio-optica | 05-01005Q | |
| Harris haematoxylin non Papanicolau | Bio-optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-optica | 05-M11007 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366931(great) | |
| 2366925(small) | |||
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 |
Riferimenti
- Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).
- Bragonzi, A. Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens. IJMM. 300, 584-593 (2010).
- Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G., Bass, J. A. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).
- Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia. Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).
- Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres. APMIS. 98, 203-211 (1990).
- Bragonzi, A., et al. Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model. J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).
- van Heeckeren, A. M. Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection. Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM. 180, 138-145 (2009).
- Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A., Filloux, S., Ramos, J. L. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. , (2014).
- Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 .
- Paroni, M. Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment. J. Infect. Dis. In press, .
- Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence.. AJRCCM. In press, (2009).
- Pirone, L., et al. Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains. Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).
- Bragonzi, A., et al. Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response. PLoS One. 7, .
- Bianconi, I., et al. Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection. PLoS Pathog.. 7, (2011).
