Long Term Chronische<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Luchtweginfectie in Muizen
Summary
We beschrijven de agar-kralen methode om hardnekkige langdurige chronische Pseudomonas aeruginosa luchtweginfectie te vestigen in het muismodel.
Abstract
Een muismodel van chronische luchtweg infectie is een belangrijke troef bij cystic fibrosis (CF) onderzoek, maar er zijn een aantal problemen met betrekking tot het model zelf. Vroege fasen van ontsteking en infectie zijn uitgebreid bestudeerd met de Pseudomonas aeruginosa agar-kralen muismodel, terwijl slechts weinig verslagen gericht op de lange termijn chronische infectie in vivo. De belangrijkste uitdaging voor de lange termijn chronische infectie blijft de lage bacteriële last van P. aeruginosa en het lage percentage geïnfecteerde muizen weken na prikkeling, hetgeen aangeeft dat bacteriële cellen progressief worden gewist door de gastheer.
Dit document presenteert een werkwijze voor het verkrijgen van efficiënte langdurige chronische infectie in muizen. Deze methode is gebaseerd op de inbedding van de P. klinische aeruginosa stammen in de agar-kralen in vitro, gevolgd door intratracheale indruppeling in C57Bl/6NCrl muizen. Bilaterale longinfectie wordt geassocieerd met SEVmene meetbare read-outs waaronder gewichtsverlies, sterfte, chronische infectie, en ontstekingsreactie. De P. aeruginosa RP73 klinische stam werd de voorkeur boven de PAO1 referentielaboratorium stam omdat het resulteerde in een relatief lagere sterfte, meer ernstige letsels, en hogere chronische infectie. P. aeruginosa kolonisatie kunnen blijven bestaan in de long voor meer dan drie maanden. Murine longpathologie lijkt op die van CF patiënten met geavanceerde chronische longziekte.
Dit muizenmodel dichtst bootst het verloop van de ziekte bij de mens kan worden gebruikt voor zowel onderzoek naar de pathogenese en de evaluatie van nieuwe therapieën.
Introduction
Cystische fibrose (CF) is een genetische ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in het cystische fibrose transmembraan geleiding regulator (CFTR) gen. Dit gen codeert voor een chloride kanaal tot expressie gebracht op het membraan van de meeste epitheelcellen. Bronchiëctasieën, slijm plugging en parenchymcellen vernietiging voornamelijk veroorzaakt door Pseudomonas aeruginosa infecties geleidelijk leiden tot ernstige longziekte en sterfte in de meeste van de CF-patiënten 1. Inzicht CF pathogenese en verdere ontwikkeling van nieuwe therapieën afhankelijk diermodel met karakteristieke kenmerken van CF. Verscheidene muizen, genetisch gemodificeerd voor het CFTR gen, zijn gegenereerd, maar beperkingen in het vermogen van deze soorten CF-achtige longziekte en diverse andere organen afwijkingen waargenomen bij CF-patiënten herhalen zijn gedocumenteerd 2.
Ontwikkeling van de infectie is een van de grote uitdagingen in de CF diermodel. De literatuur clvroeg suggereert dat een chronische infectie die langer dan een maand kan alleen worden bereikt als muizen worden geënt met bacteriën ingebed in een immobiliseringsmiddel zoals agar, agarose, of zeewier alginaat 3-5. Deze immobiliseren agents de micro-aërobe / anaërobe omstandigheden waarmee bacteriën om te groeien in de vorm van microkolonies, vergelijkbaar met de groei in het slijm van CF-patiënten 6. Dit model van chronische infectie leidt tot de persistentie van de bacteriën in de longen veroorzaakt luchtwegontsteking en beschadiging 7. Afhankelijk van de gebruikte methode, de bacteriestam geïnoculeerd en de dosis in de longen, het percentage chronische geïnfecteerde muizen en de bacteriële verontreiniging teruggevonden in de longen op verschillende tijdstippen kunnen aanzienlijk verschillen. Met name de belangrijkste uitdaging voor de lange termijn chronische infectie blijft de lage bacteriële last van P. aeruginosa en het lage percentage geïnfecteerde muizen weken na uitdaging, hetgeen that bacteriecellen geleidelijk gewist door de gastheer. Door het selecteren van P. aeruginosa RP73 klinische stam uit een verzameling van CF isoleert 8 we met succes lage sterfte, meer ernstige letsels, en hoog percentage van chronische infectie verkregen met een stabiele bacteriële verontreiniging tot een maand in C57Bl/6NCrl muizen.
Dit document beschrijft de methodiek voor het inbedden van P. aeruginosa in de agar kralen, we hebben geïnfecteerde muizen intratracheale instillatie, gemeten de bacteriële verontreiniging en cytokines in de longen, verzameld BAL vloeistof en uitgevoerd histologisch onderzoek. Over het algemeen zal dit protocol onderzoekers te helpen bij het aanpakken van fundamenteel belangrijke vragen over pathogenese 8,9 en testen van nieuwe therapieën tegen P. aeruginosa chronische infectie 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritische stappen in de P. aeruginosa-kralen voorbereiding en muis uitdaging worden hieronder vermeld.
De P. aeruginosa stam gebruikt voor muizen uitdaging is van cruciaal belang. Sterfte, chronische infectie of klaring kan aanzienlijk verschillen afhankelijk van de bacteriestam die voor de uitdaging. De P. aeruginosa RP73 klinische stam werd de voorkeur boven de PAO1 referentielaboratorium stam omdat het resulteerde in een relatief lagere sterfte, meer ernstige…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in BRAGONZI het laboratorium is gefinancierd door de Italiaanse Cystic Fibrosis Stichting (CFaCore) en EU-F7-2009-223670. Een deel van dit werk werd uitgevoerd in ALEMBIC, een geavanceerde microscopie laboratorium, en de muis histopathologie werd uitgevoerd in de eenheid van de pathologische anatomie (San Raffaele Wetenschappelijk Instituut).
Materials
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml syringe 25 G 5/8'' 0.5 x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22GA 0.9 x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% neutral buffered formalin | Bio-optica | 05-01005Q | |
| Harris haematoxylin non Papanicolau | Bio-optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-optica | 05-M11007 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366931(great) | |
| 2366925(small) | |||
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 |
Riferimenti
- Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).
- Bragonzi, A. Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens. IJMM. 300, 584-593 (2010).
- Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G., Bass, J. A. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).
- Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia. Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).
- Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres. APMIS. 98, 203-211 (1990).
- Bragonzi, A., et al. Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model. J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).
- van Heeckeren, A. M. Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection. Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM. 180, 138-145 (2009).
- Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A., Filloux, S., Ramos, J. L. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. , (2014).
- Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 .
- Paroni, M. Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment. J. Infect. Dis. In press, .
- Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence.. AJRCCM. In press, (2009).
- Pirone, L., et al. Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains. Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).
- Bragonzi, A., et al. Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response. PLoS One. 7, .
- Bianconi, I., et al. Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection. PLoS Pathog.. 7, (2011).
