Chronique à long terme<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Infection des voies respiratoires chez les souris
Summary
Nous décrivons la méthode agar-perles d'établir une infection persistante chronique des voies respiratoires à Pseudomonas aeruginosa à long terme dans le modèle de la souris.
Abstract
Un modèle de souris de l'infection chronique des voies respiratoires est un atout majeur dans la fibrose kystique (FK) la recherche, mais il ya un certain nombre de préoccupations concernant le modèle lui-même. Les premières phases de l'inflammation et de l'infection ont été largement étudiés en utilisant le modèle d'agar-perles souris Pseudomonas aeruginosa, tandis que peu de rapports ont mis l'accent sur l'infection chronique à long terme in vivo. Le principal défi pour l'infection chronique à long terme reste la faible charge bactérienne par P. aeruginosa et le faible pourcentage de semaines de souris infectées après l'épreuve, ce qui indique que les cellules bactériennes sont progressivement effacés par l'hôte.
Cet article présente une méthode pour obtenir une infection chronique efficace à long terme chez la souris. Cette méthode est basée sur l'incorporation de la P. souches cliniques aeruginosa dans l'agar-perles in vitro, suivie par instillation intratrachéale chez les souris C57Bl/6NCrl. Infection pulmonaire bilatérale est associée à plusieurs mesurables lecture-out, y compris la perte de poids, la mortalité, l'infection chronique, et la réponse inflammatoire. Le P. souche clinique aeruginosa RP73 a été préférée à la souche de laboratoire de référence de PAO1 car elle a entraîné une mortalité relativement bas, des lésions plus sévères, et l'infection chronique plus élevé. P. aeruginosa colonisation peut persister dans le poumon pendant plus de trois mois. Pathologie pulmonaire murin ressemble à celle de patients atteints de mucoviscidose avec une maladie pulmonaire chronique avancée.
Ce modèle murin imite plus étroitement le cours de la maladie chez l'homme et peut être utilisé à la fois pour des études sur la pathogenèse et pour l'évaluation de nouvelles thérapies.
Introduction
La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique causée par des mutations dans le régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) de gène. Ce gène code pour un canal chlorure exprimé sur la membrane de la plupart des cellules épithéliales. Dilatation des bronches, quantité de mucus et parenchymateuse destruction causée principalement par des infections à Pseudomonas aeruginosa conduit progressivement à une maladie pulmonaire grave et de mortalité dans la plupart des patients atteints de mucoviscidose 1. Comprendre la pathogenèse de la CF et le développement de nouvelles thérapies reposent sur un modèle animal avec caractéristiques de FC. Plusieurs souris, génétiquement modifiées pour le gène CFTR ont été générés, mais limites dans la capacité de ces espèces de récapituler les maladies pulmonaires CF-comme et plusieurs autres anomalies des organes observés chez les patients CF ont été largement documentés 2.
Développement de l'infection est l'un des défis majeurs dans le modèle animal FC. Les cl de la littératuresuggère que tôt une infection chronique durant plus d'un mois peut être atteint que si les souris sont inoculés avec des bactéries incorporées dans un agent d'immobilisation tels que l'agar, agarose, ou algues alginate 3-5. Ces agents immobilisants fournissent les conditions microaérobie / anaérobies qui permettent aux bactéries de se développer sous la forme de microcolonies, de façon similaire à la croissance dans le mucus de patients atteints de mucoviscidose 6. Ce modèle de l'infection chronique conduit à la persistance de la bactérie dans les poumons, causant une inflammation des voies respiratoires et des dommages 7. Toutefois, en fonction de la méthode utilisée, la souche bactérienne et la dose inoculée dans les poumons, le pourcentage de souris infectées chroniques et la charge bactérienne dans les poumons récupéré à différents points dans le temps peuvent varier considérablement. En particulier, le principal défi pour l'infection chronique à long terme reste la faible charge bactérienne par P. aeruginosa et le faible pourcentage de semaines de souris infectées après l'épreuve, indiquant thacellules bactériennes sont progressivement effacés t par l'hôte. En sélectionnant le P. aeruginosa RP73 souche clinique d'une collection de FC isole 8 nous avons obtenu avec succès une faible mortalité, des lésions plus sévères, et le pourcentage élevé d'infection chronique avec une charge bactérienne stable jusqu'à un mois chez la souris C57Bl/6NCrl.
Ce document détaille la méthodologie pour intégrer P. aeruginosa dans les billes d'agar-agar, nous avons des souris infectées par instillation intratrachéale, mesuré la charge bactérienne et des cytokines dans les poumons, recueillies LBA et effectué un examen histologique. Dans l'ensemble, ce protocole aidera les chercheurs à répondre à des questions d'une importance fondamentale sur la pathogenèse 8,9 et de tester de nouvelles thérapies contre P. aeruginosa infection chronique 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes essentielles de la P. aeruginosa-perles préparation et le défi de la souris sont présentés ci-dessous.
La souche de P. aeruginosa utilisé pour les souris défi est critique. La mortalité, une infection chronique ou clairance peuvent différer sensiblement en fonction de la souche bactérienne utilisée pour le défi. Le P. souche clinique aeruginosa RP73 a été préférée à la souche de laboratoire de référence de PAO1 car e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Recherche dans le laboratoire de Bragonzi a été financé par la Fondation italienne de la fibrose kystique (CFaCore) et de l'UE-F7-2009-223670. Une partie de ce travail a été réalisé dans ALEMBIC, un laboratoire de microscopie de pointe, et l'histopathologie de la souris a été réalisée dans l'Unité d'anatomie pathologique (San Raffaele Scientific Institute).
Materials
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml syringe 25 G 5/8'' 0.5 x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22GA 0.9 x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% neutral buffered formalin | Bio-optica | 05-01005Q | |
| Harris haematoxylin non Papanicolau | Bio-optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-optica | 05-M11007 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366931(great) | |
| 2366925(small) | |||
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 |
Riferimenti
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