Long Term cronica<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Infezione delle vie aeree nei topi
Summary
Descriviamo il metodo di agar-perle di stabilire persistente a lungo termine infezione delle vie respiratorie Pseudomonas aeruginosa cronica nel modello di topo.
Abstract
Un modello murino di infezione cronica delle vie aeree è un asset fondamentale nella fibrosi cistica (CF) di ricerca, anche se ci sono una serie di preoccupazioni per quanto riguarda il modello stesso. Prime fasi di infiammazione e infezione sono stati ampiamente studiati utilizzando il modello di agar-perle del mouse Pseudomonas aeruginosa, mentre solo pochi studi si sono concentrati sulla infezione cronica a lungo termine in vivo. La sfida principale per l'infezione cronica a lungo termine rimane la bassa carica batterica da P. aeruginosa e la bassa percentuale di infetti settimane topi dopo sfida, indicando che le cellule batteriche vengono progressivamente cancellati dall'host.
Questo articolo presenta un metodo per ottenere efficiente infezione cronica a lungo termine in topi. Questo metodo si basa sul radicamento del P. aeruginosa ceppi clinici nei agar-perle in vitro, seguita da instillazione nei topi C57Bl/6NCrl. Infezione polmonare bilaterale è associato SEVrali misurabili read-out, tra cui la perdita di peso, la mortalità, infezione cronica, e la risposta infiammatoria. Il P. aeruginosa RP73 ceppo clinico è stato preferito rispetto al ceppo di laboratorio di riferimento PAO1 quanto ha determinato una mortalità relativamente bassa, le lesioni più gravi, e l'infezione cronica più elevata. P. colonizzazione aeruginosa può persistere nel polmone per oltre tre mesi. Murini patologia polmonare assomiglia a quella di pazienti CF con malattia avanzata cronica polmonare.
Questo modello murino imita più da vicino il corso della malattia umana e può essere utilizzato sia per studi sulla patogenesi e per la valutazione di nuove terapie.
Introduction
La fibrosi cistica (CF) è una malattia genetica causata da mutazioni nel transmembrana della fibrosi cistica regolatore della conduttanza (CFTR). Questo gene codifica per un canale del cloro espressi sulla membrana della maggior parte delle cellule epiteliali. Bronchiectasia, muco tamponamento e parenchimale distruzione causata principalmente da infezioni da Pseudomonas aeruginosa progressivamente portare a grave malattia polmonare e la mortalità nella maggior parte dei pazienti CF 1. Capire patogenesi CF e l'ulteriore sviluppo di nuove terapie si basano su modello animale con le caratteristiche di CF. Diversi topi, geneticamente modificati per il gene CFTR, sono stati generati, ma limitazioni nella capacità di queste specie di ricapitolare malattia polmonare CF-simili e diverse altre anomalie di organi visto in pazienti CF sono stati ampiamente documentati 2.
Sviluppo di infezione è una delle principali sfide CF modello animale. I cl letteraturasuggerisce presto che una infezione cronica che dura più di un mese può essere raggiunto solo se i topi vengono inoculati con i batteri incorporati in un agente di immobilizzazione come agar, agarosio, o alghe alginato 3-5. Questi agenti immobilizzanti forniscono le condizioni microaerobica / anaerobiche che permettono ai batteri di crescere in forma di microcolonie, analogamente alla crescita nel muco dei pazienti FC 6. Questo modello di infezione cronica porta alla persistenza dei batteri nei polmoni causando infiammazione delle vie respiratorie e danni 7. Tuttavia, a seconda del metodo utilizzato, il ceppo batterico e la dose inoculato nei polmoni, la percentuale di topi infettati croniche e la carica batterica recuperato nei polmoni a differenti tempi possono differire considerevolmente. In particolare, la sfida principale per l'infezione cronica a lungo termine rimane la bassa carica batterica da P. aeruginosa e la bassa percentuale di infetti settimane topi dopo sfida, indicando that cellule batteriche vengono progressivamente cancellati dall'host. Selezionando il P. aeruginosa RP73 ceppo clinico da una raccolta di CF isolati 8 abbiamo ottenuto con successo una bassa mortalità, le lesioni più gravi, e l'alta percentuale di infezione cronica con una carica batterica stabile fino a un mese nei topi C57Bl/6NCrl.
Dettagli Questo documento metodologia per l'incorporamento P. aeruginosa nelle perle di agar, abbiamo infettato topi mediante instillazione, misurata la carica batterica e citochine nei polmoni, raccolta BAL ed eseguito un esame istologico. Nel complesso, questo protocollo sarà di aiuto ai ricercatori per affrontare questioni di fondamentale importanza sulla patogenesi 8,9 e testare nuove terapie contro il P. aeruginosa infezione cronica 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le fasi critiche del P. aeruginosa-perline preparazione e la sfida del mouse sono riportati di seguito.
Il ceppo P. aeruginosa utilizzato per i topi sfida è critica. Mortalità, infezione cronica o di liquidazione potrebbero differire significativamente a seconda del ceppo batterico utilizzato per la sfida. Il P. aeruginosa RP73 ceppo clinico è stato preferito rispetto al ceppo di laboratorio di riferimento PAO1 quanto ha determinato una mortalità relat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca nel laboratorio di Bragonzi è stato finanziato dalla Fondazione Italiana Fibrosi Cistica (CFaCore) e UE-F7-2009-223.670. Parte di questo lavoro è stato svolto in ALEMBIC, un laboratorio di microscopia avanzata, e il mouse istopatologia è stato eseguito presso l'Unità di Anatomia Patologica (Istituto Scientifico San Raffaele).
Materials
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml syringe 25 G 5/8'' 0.5 x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22GA 0.9 x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% neutral buffered formalin | Bio-optica | 05-01005Q | |
| Harris haematoxylin non Papanicolau | Bio-optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-optica | 05-M11007 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366931(great) | |
| 2366925(small) | |||
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 |
Riferimenti
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