Summary

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em> In Vivo</em> Elektroporasyon

Published: June 30, 2012
doi:

Summary

Fare iç kulak olan gelişim programı gebelikte özenli bir taslakları kaynaklı duyu organıdır. Biz bir tanımlamak<em> Utero</emÜç adımdan oluşan> gen transferi tekniği: fare ventral laparatomi, transuterine mikroenjeksiyon ve<em> In vivo</em> Elektroporasyon. Biz kritik deney embriyolojik tekniklerini göstermek için dijital video mikroskobu kullanın.

Abstract

; Kesecik ve kesecik içinde makulaları ve kıvrılmış kokleadaki Corti organı semisirküler kanalların ampullae 3 krista: memelilerin iç kulağının 6 farklı duyusal epitel vardır. Krista ve makulaları Corti organı işitsel saç hücreleri 1 işitme için birincil dönüştürücüler ise mekanik uyarıcılar, denge, özel anlamda hizmet etmek için transdüksiyonu vestibüler saç hücreleri içerir. Semisirküler kanallar ve koklea bu duyusal epitel ve morfonogenezi Hücre kaderi şartname fare gebeliğin ikinci haftasında gerçekleşecek ve büyük ölçüde doğumdan 2,3 önce tamamlanır. Fare iç kulak gelişim çalışmaları rutin hücresel ve / veya morfolojik fenotipleri 4,5 moleküler temelini anlamak için farklı embriyonik ya da doğum sonrası aşamalarında transgenik embriyolar hasat tarafından yürütülmektedir. Biz utero gelişmekte fare iç kulak veren gen transferi hipotez </ Em> kazanç ve kayıp fonksiyon-çalışmaları bağlamında memelilerin iç kulağının gelişimi 6 altında yatan genetik mekanizmalar sorgulama için geleneksel fare transgenesis için ücretsiz bir yaklaşımı temsil ediyor.

Ventral laparatomi) 1, 2) transuterine mikroenjeksiyon; ve in vivo elektroporasyon 3): Gelişmekte olan fare iç kulağa gen misexpression çalışmalar yapmak, deneysel paradigma burada gösterdiği üç genel adım içine giderir. Ventral laparotomi implante embriyo 7 deneysel erişmek için rahim dışsallaştırılmasını izin veren bir fare hayatta bir cerrahi tekniktir. Transuterine mikroenjeksiyon otik vezikül veya otocyst lümenine plazmid ifade tanıtmak Eğimli, cam kılcal mikropipetler kullanılmasıdır. Vivo elektroporasyon progenitör hücreler 8-10 içine plazmid ifade sürmek için kare dalga, akım darbeleri uygulamasıdır.

<p class = "jove_content"> Biz daha önce bu elektroporasyon tabanlı gen transferi tekniğini tarif ve protokolün 11 her adımla ilgili ayrıntılı notlar yer. Fare deneysel embriyolojik teknikleri nesir öğrenmek ve hareketsiz görüntüleri tek başına zor olabilir. Bu çalışmada, biz gen transferi prosedürü 3 adım göstermektedir. En önemlisi, biz nasıl tam olarak göstermek için dijital video mikroskopi dağıtmak: 1) anne karnında embriyo yönünü belirlemek; 2) otocyst için enjeksiyon hedefleme için embriyo edinenlerin; 3) embriyonik gün 11.5 olarak otocyst içine izleyici boya solüsyonu ile karıştırılarak DNA microinject ve 12.5; doğumda doğum sonrası seçim için ve 5) etiket electroporated embriyolar; 4) enjekte otocyst electroporate. Ortak metodolojik hataları önlemek için nasıl tartışmak;; otocyst mistargeting en sık nedenler resimsel bir kılavuz; başarıyla transfekte iç kulaklarında temsilcisi örnekler sağlamak ve utero g bir yazmak için mevcut esaslarıene transferi hayvan bakım protokolü.

Protocol

1. Ventral Laparotomi Sodyum pentobarbital anestezik solüsyonu (gram vücut ağırlığı başına 7.5 uL) intraperitoneal enjeksiyonu ile; olan embriyoların embriyonik günde 11.5 (vajinal fiş algılandığında gün öğleden embriyonik gelişimin günlük 0.5 E11.5) altındadır baraj uyutmak. Anestezik solüsyonu Çalışma; mutlak etanol, 100 uL, 65 mg / mL sulu magnezyum sülfat (uterin tonu modüle) arasında 320 uL, 50 mg / mL sodyum pentobarbital çözeltisinin 180 uL ve propilen glikol 400 uL (sa…

Discussion

Gelişmekte olan fare iç kulağa gen transferi: Fare iç kulak postimplantation gelişim 12,13 ilk haftasında kulak taslakları gelişir. Embriyonik günde 9.5 (E9.5) tarafından, taslakları invajine ve otocyst 2 adı verilen bir sıvı dolu vesikül dönüştü. Vezikül içinde kulak öncüleri olgun iç kulak içinde duyusal ve duyunun hücreleri gibi vestibüler ve işitsel epitelde mekanik hassas kıl hücreleri innerve nöronlar doğurur. Geç evrelerinde olarak, iç kulak…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz aslında başvuru 11 sayfa 130 çıktı mikroenjeksiyon pipeti üretim rakamı yayınlamak için izin Humana Basın teşekkür ederim; videografisi için Larry Dlugas ve Steven Wong, Eğitim İletişim OHSU Bölümü, video tasarım ve düzenleme için Larry Dlugas; Adam M. Ç 'Quinn, Kıdemli Tasarımcısı, teknik şematik sağlamak için özel yatay laminer akış kaput ve Les Goldsmith tasarımı için Trion / Envirco; Victor Monterroso, OG, Yüksek Lisans, Doktora ve Tom Chatkupt, DVM, Karşılaştırmalı Tıp OHSU Bölümü, rehberlik için bizim ile hayvan bakım protokolü, cerrahi teknikler ve profilaktik analjezi rejimi; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, veteriner dikiş teknikleri üzerine sadaka paylaşmak için; bizim Adobe Premiere Pro video mikroskopi bilgisayar iş istasyonu tasarımı için Edward Porsov, MS, ve Leah Beyaz ve LNS Jonas Hinckley (Portland, OR) Captioning. Bu çalışma Sağırlık ve Othe Ulusal Enstitüsü bağışları ile desteklenmiştirr İletişim Bozuklukları: DC R01 008.595 ve DC R01 008.595-04S2 (JB) ve P30 DC005983 (Oregon İşitme Araştırma Merkezi Çekirdek Grant, Peter Gillespie, Proje Yürütücüsü).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Micro Sterilizing Case ROBOZ RS-9900a 8X8.5X1.25 inches
Ball-tipped scissors Fine Science Tools 14109-09  
Ring forceps Fine Science Tools 11106-09 4.8mm ID/6mm OD
Adson Tissue Forceps Fine Science Tools 11027-12  
Needle driver Fine Science Tools 12502-12  
Allergy Syringe Tray Becton Dickison 305536  
Suture 6-0 Syneture GL-889 0.7 metric gastrointestinal suture
Lactated Ringer’s Injection USP Baxter 2B2323  
Fast green Sigma Aldrich F7258  
Borosilicate glass capillary Harvard Apparatus 30-0053  
Nembutal Sodium Solution OVATION Pharmaceuticals Inc. NDC 67386-501-52  
MgSO4.7H2O Fisher Scientific M63-500  
Propylene glycol Fisher Scientific P355-1  
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500  
Meloxicam Boehringer Ingeheim NADA 141-219  
Micropipette Puller Sutter Instruments P-97 FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments
Microelectrode Beveler Sutter Instruments BV-10 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory
Micropipette holder Warner Instruments MP-S15T For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing.
Tweezers-style electrode Protech International Inc. CUY650P5 5 mm outer diameter
Square Wave Electroporator Protech International Inc. CUY21EDIT Footpedal recommended
PICOSPRITZER III Parker Hannifin 051-0500-900 Footpedal recommended
Manual Control Micromanipulator Harvard Apparatus 640056  
Horizontal laminar flow clean bench Envirco   Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic.
Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine Bartels and Stout and Lumencor MZ10F with Lumencor SOLA light engine Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended
Alexa Fluor 594 Dextran Invitrogen D22913 10mg/ml, aqueous
Alexa Fluor 488 Dextran Invitrogen D22910 10mg/ml, aqueous
Enviro-dri Shepherd Specialty Papers   www.ssponline.com

Riferimenti

  1. Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
  2. Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
  3. Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
  4. Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
  5. Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
  6. Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
  7. . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2010).
  8. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
  9. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
  12. Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
  13. Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , 1-77 (1971).
  14. Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
  15. Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
  16. Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
  17. Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
  18. Perret-Gentil, M. . Principles of Veterinary Suturing. , .
  19. Oesterle, A. . P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , (2011).

Play Video

Citazione di questo articolo
Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation. J. Vis. Exp. (64), e3653, doi:10.3791/3653 (2012).

View Video