Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr<em> In Vivo</em> Die Elektroporation
Summary
Die Maus ist eine Innenohr-derived Plakode Sinnesorgan, dessen Entwicklungs-Programm wird während der Schwangerschaft erarbeitet. Wir definieren ein<em> In der Gebärmutter</em> Gentransfer-Technik, bestehend aus drei Schritten: Maus ventralen Laparotomie, transuterine Mikroinjektion, und<em> In-vivo-</em> Elektroporation. Wir nutzen digitale Video-Mikroskopie, um die kritischen experimentellen embryologischen Techniken zu demonstrieren.
Abstract
Die Säugetier-Innenohr hat 6 verschiedene Sinnesepithelien: 3 Cristae in den Ampullen der Bogengänge; Maculae im Utriculus und Sacculus, und das Corti-Organ in der Coiled Cochlea. Die Cristae und Maculae enthalten vestibulären Haarzellen, die mechanische Reize, um die besonderen Sinn für Ausgewogenheit dienstbar, während auditiven Haarzellen im Corti-Organ die primären Wandler für Hörgeräte sind ein transduzieren. Zellschicksals Spezifikation in diesen Sinnesepithelien und Morphogenese der Bogengänge und Hörschnecke finden während der zweiten Woche der Schwangerschaft in der Maus und sind weitgehend vor der Geburt 2,3 abgeschlossen. Entwicklungsstudien der Maus Innenohr werden routinemäßig von der Ernte transgenen Embryonen bei unterschiedlichen embryonalen oder postnatalen Stadien, um Einblick in die molekularen Grundlagen der zellulären und / oder morphologische Phänotypen gewinnen 4,5 durchgeführt. Wir vermuten, dass Gen-Transfer in die Entwicklungsländer Maus Innenohr in utero </ Em> im Rahmen der Gewinn-und Verlust-of-function-Studien stellt einen kostenlosen Zugang zur traditionellen Maus-Transgenese für die Abfrage der genetischen Mechanismen, die Säugetier-Innenohr Entwicklung 6.
Das experimentelle Paradigma zur Gen Fehlexpression Studien im sich entwickelnden Maus Innenohr führen demonstriert hier löst sich in drei Schritten: 1) ventrale Laparotomie; 2) transuterine Mikroinjektion, und 3) in vivo Elektroporation. Ventralen Laparotomie ist eine Maus Überleben chirurgische Technik, die Externalisierung der Gebärmutter ermöglicht, experimentelle Zugang zu den implantierten Embryonen 7 zu gewinnen. Transuterine Mikroinjektion ist die Verwendung von abgeschrägten, Glaskapillare Mikropipetten Expressionsplasmid in das Lumen des Ohr-Vesikel oder otocyst einzuführen. In-vivo-Elektroporation die Anwendung von Rechteckwellen, direkte Stromimpulse an Expressionsplasmid in Vorläuferzellen 8-10 anzutreiben.
<p class = "jove_content"> Wir haben bereits zuvor diese Elektroporation-basierte Gentransfer-Technik und enthalten detaillierte Notizen auf jedem Schritt des Protokolls Nr. 11. Maus experimentellen embryologischen Techniken kann schwierig sein, von Prosa zu lernen und Standbilder allein. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir, die 3 Schritte in der Gen-Transfer Verfahren. Die meisten kritisch, setzen wir digitale Video-Mikroskopie genau zeigen, wie man: 1) zu identifizieren Embryo Orientierung in utero, 2) neu zu orientieren Embryonen für die gezielte Injektionen an den otocyst; 3) microinject DNA mit Tracer-Farbstoff-Lösung in die otocyst gemischt an embryonalen Tag 11,5 und 12,5; 4) elektroporieren des eingespritzten otocyst und 5) Label elektroporiert Embryonen für postnatale Auswahl bei der Geburt. Wir bieten repräsentative Beispiele von erfolgreich transfizierten Innenohr; eine bildliche Anleitung zu den häufigsten Ursachen von otocyst Misstargeting; diskutieren, wie man gemeinsame methodische Fehler zu vermeiden; und Gegenwart Leitlinien für ein Schreiben in utero gEn-Transfer-Protokoll Tierpflege.Protocol
Discussion
Gentransfer in sich entwickelnden Maus Innenohr: Das Innenohr der Maus entwickelt sich aus der Ohrplakode während der ersten Woche der Einnistung Entwicklung 12,13. Von embryonalen Tag 9,5 (E9.5) hat die Plakode eingestülpt und verwandelte sich in einem mit Flüssigkeit gefüllten Vesikel genannt otocyst 2. Otic Vorstufen in der Blase führen zu den sensorischen und nichtsinnlichen Zellen innerhalb des reifen Innenohr sowie die Neuronen, die mechanisch empfindlichen Haarzellen in…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Humana Press für die Erlaubnis, die Mikroinjektion Pipette Herstellung Figur, die ursprünglich auf Seite 130 der Verweis 11 erschienen zu veröffentlichen; Larry Dlugas und Steven Wong, OHSU Abteilung Pädagogische Kommunikation, für die Videografie; Larry Dlugas für Video-Design und-Bearbeitung; Adam M. O 'Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco für die Gestaltung unserer kundenspezifischen horizontale Laminarströmungshaube und Les Goldsmith für die Bereitstellung der technischen schematische; Monterroso Victor, MW, MS, PhD und Tom Chatkupt, DVM, OHSU Abteilung für Vergleichende Medizin, zur Orientierung mit unseren Tierpflege-Protokoll, chirurgische Techniken, und eine prophylaktische Therapie Analgesie; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, für die gemeinsame Nutzung seiner Handzettel auf tierärztliche Nahttechniken; Edward Porsov, MS, für die Gestaltung unserer Adobe Premiere Pro Video-Mikroskopie Computer-Arbeitsplatz, und Leah und Weiß Jonas Hinckley von LNS Captioning (Portland, OR). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute on Taubheit und anderen, unterstütztr Communication Disorders: DC-und DC-008595 R01 R01 008.595-04S2 (JB) und P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Center Core-Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | ROBOZ | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | Becton Dickison | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals Inc. | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
Riferimenti
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