Transferência de genes para a orelha do camundongo Desenvolvimento Inner por<em> In Vivo</em> Eletroporação
Summary
A orelha interna do rato é um órgão sensorial placode derivado cujo programa é elaborado de desenvolvimento durante a gestação. Nós definimos uma<em> In utero</em> Técnica de transferência de gene consiste de três etapas: mouse laparotomia ventral, microinjeção transuterina, e<em> In vivo</em> Eletroporação. Nós usamos a microscopia de vídeo digital para demonstrar as críticas técnicas experimentais embriológicos.
Abstract
A orelha de mamífero interior tem 6 epitélios distinta sensorial: 3 cristas na ampolas dos canais semicirculares; máculas no utrículo e sáculo e do órgão de Corti na cóclea enrolada. O cristas e máculas conter células ciliadas vestibulares que transdução estímulos mecânicos para servir à especial sentido de equilíbrio, enquanto que as células ciliadas auditivas no órgão de Corti são os transdutores primários para ouvir 1. Especificação célula destino nestas epitélio sensorial e morfogênese dos canais semicirculares e cóclea ter lugar durante a segunda semana de gestação em camundongos e são praticamente concluída antes do nascimento 2,3. Estudos sobre o desenvolvimento da orelha interna do rato são rotineiramente realizados pela colheita de embriões transgênicos em diferentes estádios de desenvolvimento embrionário ou pós-natal para obter insights sobre a base molecular do celular e / ou morfológica fenótipos 4,5. Nós supomos que a transferência de genes para a orelha interna do rato em desenvolvimento no útero </ Em> no contexto de ganho e perda de função de estudos representa uma abordagem complementar ao transgênese mouse tradicional para o interrogatório dos mecanismos genéticos subjacentes ao desenvolvimento do ouvido interno de mamíferos 6.
O paradigma experimental para realizar estudos de expressão ectópica de genes na orelha do mouse desenvolvimento interior demonstrado aqui resolve-se em três etapas gerais: 1) laparotomia ventral; 2) microinjeção transuterina e 3) em eletroporação in vivo. Laparotomia ventral é uma técnica de sobrevivência do mouse cirúrgica que permite a exteriorização do útero para ter acesso experimental para os embriões implantados 7. Microinjecção transuterina é o uso de chanfradas micropipetas, capilares de vidro para introduzir plasmídeo de expressão para dentro do lúmen da vesícula ótica ou otocyst. In vivo electroporação é a aplicação de onda quadrada, directos impulsos de corrente para dirigir a expressão de plasmídeo em 8-10 células progenitoras.
<p class = "jove_content"> Nós já descreveu esta eletroporação baseado em técnica de transferência de gene e incluiu notas detalhadas sobre cada etapa do protocolo 11. Rato experimentais técnicas embriológicas pode ser difícil de aprender com prosa e imagens por si só. No presente trabalho, demonstramos os 3 passos no processo de transferência de genes. Mais criticamente, com a implantação de microscopia de vídeo digital para mostrar precisamente como: 1) identificar a orientação do embrião no útero; 2) reorientar embriões para alvejar as injeções para o otocyst; 3) microinject DNA misturado com calda de corante no otocyst nos dias embrionárias 11,5 e 12,5; 4) electroporate o otocyst injetada e 5) embriões rótulo eletroporados para a seleção pós-natal ao nascimento. Nós fornecemos exemplos representativos de sucesso transfectadas ouvidos internos, um guia ilustrado para as causas mais comuns de mistargeting otocyst; discutir como evitar erros comuns metodológicas e diretrizes presentes para escrever um in utero geno protocolo de transferência de cuidados com animais.Protocol
Discussion
Transferência de genes para a orelha do rato em desenvolvimento interior: A orelha do rato interior se desenvolve a partir da placode ótica durante a primeira semana de pós-implantação desenvolvimento 12,13. Por dia embrionário 9,5 (E9.5), o placode tem invaginado e se transformou em uma vesícula cheia de líquido chamado otocyst 2. Precursores óticos na vesícula dar origem às células sensoriais e não-sensorial dentro do ouvido interno madura, bem como os neurónios que…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Imprensa Humana permissão para publicar a microinjeção figura fabricação pipeta que apareceu originalmente na página 130 da referência 11; Larry Dlugas e Steven Wong, OHSU Departamento de Comunicações Educacionais, para videografia; Larry Dlugas para vídeo design e edição; Adam M. O 'Quinn, Designer Sênior, Trion / Envirco para projetar nossa capela de fluxo laminar horizontal personalizado e Les Goldsmith para fornecer o esquema técnico; Victor Monterroso, MV, MS, PhD e Tom Chatkupt, DVM, OHSU Departamento de Medicina Comparada, para orientação com a nossa animais protocolo de atendimento, técnicas cirúrgicas e analgesia profilática regime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, para partilhar a sua apostila sobre técnicas de sutura veterinários; Edward Porsov, MS, para projetar nossa Adobe Premiere Pro vídeo estação de trabalho do computador microscopia, e Leah e Branco Jonas Hinckley de LNS Caption (Portland, OR). Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Surdez e outrDistúrbios r Comunicação: DC R01 008.595 008.595 R01 e DC-04S2 (JB) e P30 DC005983 (Audição do Oregon Research Center Núcleo Grant, Peter Gillespie, Investigador Principal).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | ROBOZ | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | Becton Dickison | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals Inc. | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
Riferimenti
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. . Principles of Veterinary Suturing. , .
- Oesterle, A. . P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , (2011).
