開発マウス内耳への遺伝子導入による<emインビボで></em>エレクトロポレーション
Summary
マウス内耳は、その発達プログラム妊娠中に詳述されているプラコード由来の感覚器官である。我々は定義され<em>子宮内で</em3ステップで構成される>遺伝子導入技術：マウス腹開腹、transuterineマイクロインジェクションし、<emin vivoでの></em>エレクトロポレーション。我々は、重要な実験発生学的手法を実証するためにデジタルビデオ顕微鏡を使用しています。
Abstract
、卵形嚢と球形嚢の斑およびコイル蝸牛のコルチ器官半規管の膨大部の3クリステ：哺乳類の内耳は、6異なる感覚上皮を持っています。コルチ器官における聴覚有毛細胞は、1を聞くための主要なトランスデューサている間。クリステと斑は、バランスの特別な感覚を補助するために機械的刺激を伝達する前庭有毛細胞が含まれてい三半規管と蝸牛のこれらの感覚上皮および形態形成における細胞運命の仕様では、マウスの妊娠第2週に行われ、大部分は出生2,3前に完了されています。マウス内耳の発達の研究は、日常的に4,5の細胞および/ または形態学的表現型の分子的基盤への洞察を得るために別の胚または出生後の段階でトランスジェニック胚を採取して実施しています。我々は子宮内での開発、マウス内耳にその遺伝子伝達を仮定する</ em>は、利得と損失の機能研究の文脈で哺乳類の内耳の開発6の根底にある遺伝的メカニズムの尋問のための伝統的なマウスの遺伝子組換えへの無料アプローチを表しています。
開発マウス内耳における遺伝子強制発現研究を実施するための実験パラダイムは、ここで示した3つの一般的な手順に解決される：1）腹開腹2）transuterineマイクロインジェクション、3） 生体内エレクトロポレーションインチ腹開腹術は、移植胚は7〜実験的なアクセスを得るために子宮の外部化を可能にするマウスの生存率手術手技である。 Transuterineマイクロインジェクションは、耳胞や耳胞の内腔に発現プラスミドを導入するための面取り、ガラスキャピラリーマイクロピペットを使用することである。in vivoでのエレクトロポレーションでは、前駆細胞の8-10に発現プラスミドを駆動するために方形波、直流パルスのアプリケーションです。
<p cl尻= "jove_content">我々は以前にこのエレクトロポレーションベースの遺伝子導入法を説明し、プロトコル11の各ステップで詳細なメモが含まれています。マウスの実験発生学的テクニックが散文から学び、静止画だけでは困難な場合があります。本研究では、我々は、遺伝子導入の手順の3つのステップを示しています。最も批判的に、我々は正確にどのように表示するためにデジタルビデオ顕微鏡をデプロイします。1） 子宮内で胎児の向きを識別する、2）耳胞に注射を標的とするための胚を再設定する、3）耳胞にトレーサー染料溶液と混合し、DNAを顕微注入胚の日11.5と12.5 4）注入された耳胞をエレクトロポ、5）ラベルは、出生時に出生後の選択のための胚をエレクトロポレーション。一般的な方法論的なエラーを回避する方法について説明;耳胞mistargetingの最も一般的な原因に絵のガイド、私たちは正常にトランスフェクトし、内側の耳の代表的な例を提供し、 子宮 g で書くための本ガイドラインエン転送動物ケアのプロトコル。Protocol
Discussion
開発マウス内耳への遺伝子導入：マウス内耳は、着床後の開発12,13の最初の週の間に耳プラコードから発生する。胎生9.5（E9.5）で、プラコードは陥入しており、耳胞2と呼ばれる液体で満たされた小胞に変身。小胞の耳前駆体は、成熟した内耳など前庭と聴覚感覚上皮に機械的に敏感な有毛細胞を支配するニューロン内の感覚と非感覚細胞を生じさせる。後期胚?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、もともとリファレンス11の130ページに登場し、マイクロインジェクションピペットの作製図を公開する許可をヒューマナプレスに感謝し、ビデオ撮影のためにラリーDlugasとスティーブン·ウォン、教育コミュニケーションのOHSU部、ビデオのデザインと編集のためのラリーDlugas、アダムM. O "クイン、シニアデザイナー、技術的な回路図を提供するため、カスタムの水平層流フードとLesゴールドスミスを設計するためのトリオン/ Envirco、ビクターMonterroso、MV、MS、PhDは、トム·Chatkupt、DVM、比較医学のOHSU部、指導のための私達の動物のケアのプロトコル、手術手技、および予防的鎮痛療法、マルセル·ペレ-Gentilの、DVM、MS、獣医縫合のテクニックで彼の資料を共有するため、私たちのAdobe Premiere Proのビデオ顕微鏡のコンピュータワークステーションを設計するためのエドワードPorsov、MS、およびリア白と（ポートランド、オレゴン州）キャプションLNSのジョナスヒンクリー。この作品は、難聴とオットの国立研究所からの補助金によって支えられてrのコミュニケーション障害：DC R01 008595とDC R01 008595-04S2（JB）およびP30 DC005983（オレゴン聴覚研究センターコアグラント、ピーター·ガレスピー、主任）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | ROBOZ | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | Becton Dickison | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals Inc. | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
Riferimenti
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. . Principles of Veterinary Suturing. , .
- Oesterle, A. . P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , (2011).
