Méthodes pour l'étude de la morphogenèse neuronale:<em> Ex vivo</em> Électroporation ARNi dans embryonnaire cortex cérébral murin
Summary
Pour procéder à une évaluation rapide de la fonction des gènes dans le développement du cortex cérébral, nous décrivons des procédés impliquant l'<em> Ex vivo</emÉlectroporation> de plasmides co-exprimant inhibitrice ARN (ARNi) et de la GFP dans le cortex embryonnaire murin. Ce protocole est susceptible d'être l'étude des divers aspects de développement neurologique tels que la neurogenèse, la migration neuronale et de la morphogenèse neuronale, y compris la croissance axonale et dendritique.
Abstract
Le cortex cérébral dirige les fonctions cognitives supérieures. Cette structure à six couches est généré dans un intérieur et unième, hors-dernière de manière, dans lequel les premiers neurones nés restent plus proches de l'ventricule tandis que les neurones derniers nés migrer au-delà des premiers neurones nés vers la surface du cerveau 1. En plus de la migration neuronale 2, un processus clé pour la fonction corticale normale est la régulation de la morphogenèse neuronale 3. Alors que la morphogenèse neuronale peut être étudiée di vitro dans des cultures primaires, il ya beaucoup à apprendre de la façon dont ces processus sont régis dans les environnements de tissus.
Nous décrivons les techniques pour analyser la migration neuronale et / ou la morphogenèse en tranches organotypiques du cortex cérébral 4,6. Un vecteur pSilencer modifié est utilisé, qui contient à la fois un promoteur U6 qui entraîne les ARN à double brin en épingle à cheveux et une cassette d'expression qui code pour la protéine distincte GFP entraînée bya promoteur CMV 7-9. Notre approche permet de l'évaluation rapide des défauts dans la croissance des neurites sur knockdown spécifique de gènes candidats et a été utilisé avec succès dans un écran pour les régulateurs de croissance des neurites 8. Parce que seul un sous-ensemble de cellules expriment les constructions RNAi, les tranches organotypiques de permettre une analyse de la mosaïque des phénotypes potentiels. En outre, parce que cette analyse se fait dans une approximation proche de l'environnement di vivo, il offre un faible coût et alternative rapide à la génération d'animaux transgéniques ou knock-out pour les gènes de la fonction corticale inconnue. Enfin, en comparaison avec la technologie d'électroporation in vivo, le succès des anciens expériences d'électroporation in vivo ne dépend pas de la chirurgie de développement des compétences et de maîtrise peut être réalisée avec un temps de formation plus courte et la compétence.
Protocol
Discussion
Ces procédés impliquant l'électroporation ex vivo de plasmides codant pour l'ARN double brin épingles à cheveux 8 et la culture de tranches organotypiques 4 fournissent plusieurs avantages distincts. Tout d'abord, ces méthodes permettent une évaluation rapide de l'ARNi dérivés phénotypes. L'inclusion d'une cassette d'expression codant pour la GFP dans le vecteur pSilencer même qui contient le promoteur U6 qui entraîne le double brin d'ARN en épi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Shirin Bonni pour fournir la construction pSil-GFP, M. Alper Uzun pour l'illustration de la figure 1, et l'installation de bio-imagerie Leduc pour la microscopie confocale. EMM est pris en charge par la bourse de carrière pour les sciences médicales de l'Burroughs Wellcome Fund, un NARSAD Prix des jeunes chercheurs, et les NIH NCRR COBRE P20 RR018728-01. SBL est soutenu par le NIH NCRR P20 COBRE RR018728-01, et a reçu le soutien de PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |
Riferimenti
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