Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em> Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak> RNAi Elektroporasyon
Summary
Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler açıklanmaktadır<em> Ex vivo</emPlazmit> elektroporasyon inhibitör RNA (RNAi) ve fare embriyonik kortekste GFP ortak dile getirdi. Bu protokol, nörogenez, nöronal migrasyon ve dendrit ve akson akıbet de dahil olmak üzere nöronal morfonogenezi gibi nörogelişimsel çeşitli yönleriyle incelenmesi için uygundur.
Abstract
Serebral korteks yüksek bilişsel fonksiyonları yönlendirir. Bu altı tabakalı yapı son doğan nöronlar beyin 1 yüzeyine doğru ilk doğan nöronlar geçen geçiş sırasında ilk doğan nöronlar ventrikül yakın kalır olan bir içten-birinci dış-son şekilde, oluşturulur. Nöronal migrasyon 2 ek olarak, normal kortikal işlev için bir anahtar işlemi nöronal morfojenezini 3 arasında bir düzenlemedir. Nöronal morfogenez primer kültürlerinde in vitro okudu olabilir iken, bu süreçleri doku ortamlarda nasıl düzenlendiği öğrenilecek çok şey var.
Biz serebral korteks 4,6 organotipik dilimler halinde nöronal migrasyon ve / veya morfonogenezi analiz teknikleri anlatıyoruz. Bir pSilencer modifiye vektör çift zincirli RNA firkete süren bir U6 organizatörü ve b tahrik GFP protein kodlar ayrı bir ifade kaseti hem de içerir kullanılırya CMV organizatörü 7-9. Bizim yaklaşımımız aday genler belirli devirme üzerine akson uzantısı kusurların hızlı değerlendirme sağlar ve başarılı bir akson uzantısı 8 düzenleyiciler için bir ekran kullanılmıştır. Hücrelerin sadece bir alt kümesini RNAi yapıları ifade Çünkü, organotipik dilim potansiyeli fenotipleri bir mozaik analizi için izin verir. Bu analizin in vivo ortamda bir yanında yaklaşık yapılır, çünkü Dahası, bu bilinmeyen kortikal fonksiyonunun genleri için düşük maliyetli ve transjenik hayvanların ya da boşaltma üretimi için hızlı bir alternatiftir. Son olarak, in vivo elektroporasyon teknolojisi ile karşılaştırıldığında, ex vivo elektroporasyon deneylerin başarıya yetkin cerrahi beceri geliştirme bağımlı değildir ve kısa bir eğitim süresi ve beceri ile yapılabilir.
Protocol
Discussion
Çift sarmallı RNA hairpins 8 ve 4 çok özel avantajlar sağlar organotipik dilim kültürü kodlayan plazmidlerin ex vivo elektroporasyon içeren bu yöntemleri. İlk olarak, bu yöntemler RNAi-türevi fenotip hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için olanak sağlar. Çift RNA firkete tahrik U6 promot.örünü içerir, aynı pSilencer vektör içinde bir ifade kaseti kodlama GFP dahil edilmesi RNAi vektörü ile electroporated hücrelerinin hızlı bir tanımlama ve karakterizasyonu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz pSil-GFP yapı, Şekil 1 resimde Dr Alper Uzun ve konfokal mikroskopi için Leduc biyogörüntüleme kolaylığı sağlanması için Dr Şirin Bonni teşekkür ederim. EMM Burroughs Wellcome Fonu, bir NARSAD Genç Araştırmacılar Ödülü ve NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01 Tıp Bilim Kariyer Ödülü tarafından desteklenmektedir. SBL NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01 tarafından desteklenen ve PHS NRSA 5T32MH019118-20 destek aldı.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |
Riferimenti
- Angevine, J. B., Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).
- Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).
- Guerrier, S. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis. Cell. 138, 990-990 (2009).
- Stegmuller, J. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-389 (2006).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Konishi, Y. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303, 1026-1026 (2004).
- Vankelecom, H. Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization. Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).
- Hand, R. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-45 (2005).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors. Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).
