Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:<em> Ex-vivo-</em> RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex
Summary
Um eine rasche Beurteilung der Funktion von Genen in der Entwicklung der Hirnrinde führen, beschreiben wir Verfahren, die die<em> Ex vivo</em> Elektroporation von Plasmiden co-exprimieren, inhibitorische RNA (RNAi) und GFP in murinen embryonalen Kortex. Dieses Protokoll ist offen für das Studium der verschiedenen Aspekte der Entwicklung des Nervensystems, wie zB Neurogenese, neuronale Migration und neuronalen Morphogenese einschließlich Dendriten und Axonen Auswuchs.
Abstract
Die Großhirnrinde leitet höheren kognitiven Funktionen. Diese sechs Schichtstruktur in einer Innenseite-Zuerst-, Außen-letzten Weise, in der die ersten geboren Neuronen bleiben näher an den Ventrikel während die letzten geboren Neuronen an den ersten geboren Neuronen in Richtung der Oberfläche des Gehirns 1 durchwandern erzeugt. Neben der neuronalen Migration 2, ist ein wichtiger Prozess für die normale Funktion der kortikalen Regulation der neuronalen Morphogenese 3. Während die neuronalen Morphogenese in vitro in primären Kulturen untersucht werden können, gibt es viel zu aus, wie diese Prozesse werden im Gewebe reguliert Umgebungen gelernt werden.
Wir beschreiben Techniken, um neuronale Migration und / oder Morphogenese in organotypischen Schnitten der Großhirnrinde 4,6 analysieren. Ein pSilencer modifizierte Vektor verwendet wird, die sowohl eine U6-Promotor, der die doppelsträngige Haarnadel-RNA antreibt und einen separaten Expressionskassette, die GFP-Protein codiert, b angetriebenya CMV-Promotor 7-9. Unser Ansatz ermöglicht die schnelle Beurteilung von Defekten in Neuritenwachstum auf spezifischen Knockdown von Kandidatengenen und wurde erfolgreich in einem Screen für Regulatoren der Neuritenwachstum 8 verwendet. Da nur ein Teil der Zellen die RNAi-Konstrukte zum Ausdruck bringen wird, erlauben die organotypischen Slices für ein Mosaik Analyse der potenziellen Phänotypen. Darüberhinaus ist der Analyse in einem in der Nähe Angleichung der in vivo-Umgebung durchgeführt wird, bietet es eine kostengünstige und schnelle Alternative zur Erzeugung von transgenen oder Knockout-Tieren für Gene unbekannter Kortex. Schließlich, im Vergleich zu in vivo Elektroporation Technologie, ist der Erfolg der Ex-vivo-Elektroporation Experimente nicht auf die Entwicklung von Fähigkeiten beherrschen Operation abhängig und kann mit einer kürzeren Ausbildung Zeit und Geschick durchgeführt werden.
Protocol
Discussion
Diese Verfahren, die die Ex-vivo-Elektroporation von Plasmiden, die doppelsträngige RNA-Haarnadeln 8 und Kultur der organotypischen Slices 4 bieten mehrere deutliche Vorteile. Erstens erlauben diese Methoden für eine schnelle Beurteilung der RNAi-derived Phänotypen. Die Einbeziehung einer Expressionskassette GFP-codierende in der gleichen pSilencer Vektor, der die U6-Promotor, der die doppelsträngige RNA-Haarnadel treibt enthält ermöglicht eine schnelle Identifizierung und Charakteri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Shirin Bonni für die Bereitstellung der PSIL-GFP-Konstrukt, Dr. Alper Uzun für die Darstellung von 1, und die Leduc Bioimaging Anlage für die konfokale Mikroskopie. EMM wird durch den Career Award für die medizinische Wissenschaft von der Burroughs Wellcome Fund, ein NARSAD Young Investigators Award und NIH NCRR Cobre RR018728 P20-01 unterstützt. SBL wird durch NIH P20 NCRR Cobre RR018728-01 unterstützt wird, und erhielt Unterstützung von PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |
Riferimenti
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