Использование EpiAirway модель Характеризуя Долгосрочные хост-возбудителя Взаимодействия
Summary
Этот метод позволяет характеристика расширенных бактериальные культуры совместно с EpiAirways, первичных человеческих дыхательных эпителиальных тканей, выращенных при воздушно-жидкостной интерфейс, биологически значимых<em> В пробирке</em> Модели. Подход может быть использован с любым микробом, потенциально пригодных для долгосрочного со-культуры.
Abstract
Nontypeable гемофильной инфекции (NTHi) являются человеческими адаптированных грамотрицательные бактерии, способные вызвать рецидивирующих и хронических инфекций дыхательных слизистой оболочки 1, 2. Для изучения механизмов, посредством которых эти организмы выживают и внутри дыхательной ткани, модели, в которой успешное долгосрочное сотрудничество-культуры бактерий и клеток человека могут быть выполнены не требуется. Мы используем первичных человеческих дыхательных эпителиальных тканей поднял в воздух-жидкость, модель EpiAirway (Маттек, Ashland, MA). Это без увековечено, хорошо дифференцированные, 3-мерный тканей, содержащих плотные соединения, мерцательного и nonciliated клеток, бокаловидных клеток, которые производят муцина и сохраняют способность вырабатывать цитокины в ответ на инфекцию.
Это биологически значимых в пробирке модель человеческого верхних дыхательных путей могут быть использованы в ряде способами; Общая цель этого метода заключается в проведении долгосрочных со-культуры EpiAirway тканей с NTHi и количественного клеточно-ассоциированных бактерий и внутренним течением времени . Кроме того, муцин производства и цитокинового профиля зараженного со-культур может быть определена. Такой подход улучшает существующие методы в том, что многие современные протоколы используют погруженные монослоя или Transwell культурах человеческих клеток, которые не способны поддерживать бактериальных инфекций в течение длительного периода 3. Например, если организм может размножаться в вышележащих средства массовой информации, это может привести к недопустимым уровням цитотоксичность и потери клеток хозяина, арестовав эксперимента. EpiAirway модель позволяет характеристику долгосрочного хозяин-патоген взаимодействий. Далее, поскольку источником EpiAirway является нормальной человеческой трахеобронхиального клеток, а не увековечена линия, каждый из них отличное представление реальной человеческой ткани верхних дыхательных путей, как в структуре и функции 4.
Для этого метода EpiAirway ткани отлучить от антимикробных и противогрибковых соединений в течение 2 дней до родов, и все процедуры проводятся под антибиотикам свободных условиях. Это требует специального рассмотрения, так как бактерии и первичных человеческих тканей, используемых в одном шкафу биобезопасности, и совместно культивировали в течение длительного периода времени.
Protocol
Discussion
Этот метод позволяет исследовать долгосрочные хозяин-патоген взаимодействий в биологически значимых фоне первичных человеческих тканей дыхательной на воздух-жидкость. Здесь мы использовали NTHi как заражение организма, но взаимодействие любых бактерия, которая не вносит неприемлемы?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Патрика Хэйден (Маттек) за полезные обсуждения, и Роберт Смит и Либби Перри Грузии медицинских наук университета за их навыки EM. Это исследование было профинансировано NIDCD грант DC010187 в DAD
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue# | Comments |
|---|---|---|---|
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
Riferimenti
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
