Summary

使用的EpiAirway模型,用于描述长期宿主 - 病原体相互作用

Published: September 02, 2011
doi:

Summary

此方法允许EpiAirways,初级人类呼吸道上皮组织生长在气 – 液界面,生物有关延长细菌共同培养的表征<em>在体外</em>车型。该方法可用于任何微生物,是经得起长期的合作文化。

Abstract

Nontypeable 流感嗜血杆菌 (NTHI)是人类适应革兰氏阴性菌,可引起复发和慢性感染的呼吸道粘膜1 2。要研究的机制,这些生物生存和呼吸组织内,一个是必需的,可以进行长期成功的细菌和人类细胞的共培养模式。我们使用初级人类呼吸道上皮组织,提高气 – 液界面,EpiAirway模型(MatTek,阿什兰,马萨诸塞州)。这些都是非永生化,分化良好,3维的组织,包含紧密连接,纤毛和nonciliated细胞,杯状细胞产生的粘蛋白,并保留产生细胞因子对感染的反应能力。

有关这种生物人类上呼吸道体外模型可以用在许多方面;这种方法的总体目标是,随着时间的推移执行长期NTHI和定量EpiAirway组织共培养细胞相关的和内在的细菌。同时,受感染的共同文化的生产和粘蛋白,细胞因子的个人资料才能确定。这种方法提高了,许多当前的协议后,现有的方法,利用人体细胞淹没单层或Transwell小文化,这是不能够支持长时间细菌感染超过3。例如,如果一个有机体,可以在覆媒体复制,这可能导致在宿主细胞的细胞毒性和损失不可接受的水平,逮捕了实验。 EpiAirway模型允许长期宿主 – 病原体相互作用的特性。此外,由于EpiAirway源是人体正常细胞,而不是一个永生行气管支气管,每一个实际人类上呼吸道组织的优秀代表,在结构和功能4 ,。

对于这种方法,EpiAirway组织断奶2天交货前的抗微生物和抗真菌化合物,和所有的程序都无抗生素的条件下进行。这就需要特殊的考虑,因为这两种细菌和小学的人体组织在同一生物安全柜使用,并长时间共同培养。

Protocol

1。为EpiAirway组织准备生物安全柜穿着专用的白大褂,头发绑背和手套,开始层流。 5分钟后,将在内阁(移液器,小技巧,离心管等),任何一方的工具,喷洒生物安全柜内部和窗框用70%乙醇,并用干净的纸巾擦拭。用70%乙醇再次喷洒清洁的室内,并留下来干。干净的一侧移动工具和重复乙醇的过程​​。 在内阁中的气溶胶屏障枪头和专用的移液器。要使用单独包装的无菌血清…

Discussion

这种方法允许的长期宿主 – 病原体相互作用的首要人权组织在气 – 液界面的呼吸生物学相关背景调查。在这里,我们使用了感染的有机体NTHI,但用这种方法可以量化的任何细菌的相互作用,不引入不可接受的细胞毒作用随着时间的推移。 EpiAirway模式也可以被用于研究病毒,药物或化学物质,影响人类的上呼吸道5 6 7 8。我们一直保持着超过40天,与NTHI感染的组织至少10天未感染的组织。我…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们想感谢帕特里克海登(MatTek),有益的讨论和利比的佐治亚州健康科学大学为他们的EM技能的罗伯特史密斯和佩里。这项研究是由NIDCD授予DC010187到DAD

Materials

Name of reagent Company Catalogue# Comments
Saponin Calbiochem 558255-25GM 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize
1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium Lonza 17-513Q  
1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium Lonza 17-515Q  
EpiAirway antibiotic-free tissues MatTek AIR-100-ABF  
EpiAirway antibiotic-free maintenance media MatTek AIR-100-MM-ABF Supplied with kit
10X phosphate-buffered saline solution EMD 6506 Dilute to 1X before use
Gelatin JT Baker 2124-01 Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave
Difco GC Medium Base (chocolate agar) VWR 90002-016 Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C
BBL Hemoglobin (chocolate agar) VWR 90000-662 Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above
BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) VWR 90000-414 Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates
Dissecting forceps, fine tip, curved VWR 82027-406  
Self-sealing sterilization pouches VWR 89140-802  
Gentamicin sulfate, 10 mg/ml Lonza 17-519Z Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill

Riferimenti

  1. Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
  2. Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
  3. Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
  4. Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
  5. Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
  6. Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
  7. Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
  8. Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
  9. Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
  10. Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).

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Citazione di questo articolo
Ren, D., Daines, D. A. Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (55), e3261, doi:10.3791/3261 (2011).

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