Summary

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Published: September 02, 2011
doi:

Summary

Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von ausgedehnten bakteriellen Co-Kultur mit EpiAirways, primären humanen respiratorischen Epithel an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche gewachsen, einem biologisch relevanten<em> In-vitro-</em> Modell. Der Ansatz kann mit jeder Mikrobe, die zugänglich für langfristige Zusammenarbeit Kultur verwendet werden.

Abstract

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) sind Menschen angepassten Gram-negative Bakterien, die wiederkehrende und chronische Infektionen der Schleimhaut der Atemwege 1 Ursache kann; 2. Um die Mechanismen, mit denen diese Organismen an und im respiratorischen Gewebe überleben, ein Modell, in dem langfristig erfolgreiche Co-Kultur von Bakterien und menschlichen Zellen durchgeführt wird, gefordert werden kann, zu studieren. Wir verwenden primären humanen respiratorischen Epithelzellen Gewebe angehoben, um die Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, die EpiAirway Modell (MatTek, Ashland, MA). Diese sind nicht unsterblich, gut differenzierten, 3-dimensionale Gewebe, die Tight Junctions, Flimmer-und nonciliated Zellen, Becherzellen, dass Mucin zu produzieren, und behalten die Fähigkeit, Zytokine in Reaktion auf eine Infektion zu erzeugen enthalten.

Diese biologisch relevanten In-vitro-Modell des menschlichen oberen Atemwege kann in einer Reihe von Arten verwendet werden; das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, langfristige Zusammenarbeit Kultur EpiAirway Gewebe mit NTHi und zu quantifizieren zellassoziierte und verinnerlicht Bakterien im Laufe der Zeit durchführen . Wie gut, kann Mucin Produktion und die Zytokin-Profil der infizierten Co-Kulturen bestimmt werden. Dieser Ansatz verbessert existierende Verfahren in, dass viele aktuelle Protokolle verwenden untergetaucht Mono-oder Transwell Kulturen von menschlichen Zellen, die nicht fähig sind, unterstützen bakterielle Infektionen über längere Perioden 3. Zum Beispiel, wenn ein Organismus in der darüber liegenden Medien replizieren kann, kann dies zu nicht akzeptablen Niveau der Zytotoxizität und der Verlust der Wirtszellen durch, verhaftete das Experiment. Die EpiAirway Modell ermöglicht die Charakterisierung der langfristigen Wirt-Pathogen-Interaktionen. Ferner kann, da die Quelle für die EpiAirway ist normale menschliche tracheobronchialen Zellen anstatt einer immortalisierten Linie ist jeder eine ausgezeichnete Darstellung der tatsächlichen menschlichen oberen Atemwege Gewebe, sowohl in Struktur und in Funktion 4.

Bei dieser Methode werden die EpiAirway Gewebe entwöhnt von anti-mikrobiellen und Anti-Pilz-Verbindungen für 2 Tage vor der Auslieferung, und alle Verfahren sind unter Antibiotika-freien Bedingungen durchgeführt. Dies erfordert besondere Überlegungen, da beide Bakterien und primären humanen Geweben in der gleichen Biosicherheitswerkbank verwendet werden und sind Co-Kultivierung über einen längeren Zeitraum.

Protocol

1. Vorbereiten des Biosicherheitswerkbank für die EpiAirway Gewebe Das Tragen eines speziellen Laborkittel, mit Haar zurück und Handschuhen verbunden, starten Sie den laminaren Strömung. Nach 5 Minuten, verschieben Sie alle Werkzeuge im Schrank (Pipetten, Spitzen, Reaktionsgefäße usw.) auf der einen Seite, sprühen die Biosicherheit Schrankinneren und Flügel mit 70% Ethanol und wischen Sie mit sauberen Papiertüchern. Spray die gereinigte Innenraum wieder mit 70% Ethanol und trocknen lassen. Bewegen Sie…

Discussion

Diese Methode erlaubt die Untersuchung der langfristigen Wirt-Pathogen-Interaktionen in einem biologisch relevanten Hintergrund von primären humanen respiratorischen Gewebe an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Hier haben wir NTHi als der Erreger verwendet, sondern das Zusammenspiel von Bakterien, die nicht vorstellen unannehmbar Zytotoxizität im Laufe der Zeit kann mit dieser Methode quantifiziert werden. Die EpiAirway Modell kann auch für das Studium von Viren, Medikamente oder Chemikalien, die Auswirkungen des me…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Patrick Hayden (MatTek) für hilfreiche Diskussionen danken, und Robert Smith und Libby Perry of Georgia Health Sciences University für ihre EM Fähigkeiten. Diese Studie wurde von NIDCD gewähren DC010187 zu DAD finanziert

Materials

Name of reagent Company Catalogue# Comments
Saponin Calbiochem 558255-25GM 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize
1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium Lonza 17-513Q  
1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium Lonza 17-515Q  
EpiAirway antibiotic-free tissues MatTek AIR-100-ABF  
EpiAirway antibiotic-free maintenance media MatTek AIR-100-MM-ABF Supplied with kit
10X phosphate-buffered saline solution EMD 6506 Dilute to 1X before use
Gelatin JT Baker 2124-01 Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave
Difco GC Medium Base (chocolate agar) VWR 90002-016 Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C
BBL Hemoglobin (chocolate agar) VWR 90000-662 Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above
BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) VWR 90000-414 Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates
Dissecting forceps, fine tip, curved VWR 82027-406  
Self-sealing sterilization pouches VWR 89140-802  
Gentamicin sulfate, 10 mg/ml Lonza 17-519Z Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill

Riferimenti

  1. Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
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Citazione di questo articolo
Ren, D., Daines, D. A. Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (55), e3261, doi:10.3791/3261 (2011).

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