L'utilisation du modèle EpiAirway pour Caractériser long terme Interactions hôte-pathogène
Summary
Cette méthode permet la caractérisation des bactéries étendu co-culture avec EpiAirways, des tissus humains primaires épithéliales respiratoires grandi à l'interface air-liquide, une biologiquement pertinentes<em> In vitro</em> Modèle. L'approche peut être utilisée avec n'importe quel microbe qui se prêtent à long terme de co-culture.
Abstract
Haemophilus influenzae non typables (NTHi) sont humains adaptés bactéries Gram-négatives qui peuvent causer des infections récurrentes et chroniques de la muqueuse respiratoire 1, 2. Pour étudier les mécanismes par lesquels ces organismes survivent et à l'intérieur des tissus des voies respiratoires, un modèle dans lequel réussite à long terme de co-culture de bactéries et de cellules humaines peuvent être réalisées est nécessaire. Nous utilisons des primaires respiratoire humain tissus épithéliaux soulevées à l'interface air-liquide, le modèle EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Ce sont des non-immortalisés, bien différencié, 3-dimensionnelle des tissus qui contiennent des jonctions serrées, cellules ciliées et non ciliées, des cellules caliciformes qui produisent la mucine, et conserver la capacité de produire des cytokines en réponse à l'infection.
Cette biologiquement pertinentes modèle di vitro de la voie aérienne supérieure humaine peut être utilisée dans un certain nombre de façons, l'objectif global de cette méthode consiste à effectuer à long terme de co-culture de tissus EpiAirway avec NTHi et quantifier les bactéries associées aux cellules et intériorisé au fil du temps . De même, la production de mucine et le profil des cytokines de l'infection co-cultures peuvent être déterminées. Cette approche améliore les méthodes existantes dans ce nombreux protocoles actuels utilisent des cultures monocouches ou submergés Transwell de cellules humaines, qui ne sont pas capables de soutenir les infections bactériennes sur de longues périodes 3. Par exemple, si un organisme peut se répliquer dans les médias sus-jacent, ce qui peut entraîner des niveaux inacceptables de la cytotoxicité et la perte de cellules de l'hôte, en arrêtant l'expérience. Le modèle permet de caractériser EpiAirway long terme interactions hôte-pathogène. En outre, depuis la source de la EpiAirway est normal humaine trachéo-bronchique cellules plutôt que d'une ligne immortalisé, chacun est une excellente représentation de tissus humains réels des voies respiratoires supérieures, tant dans sa structure et dans la fonction 4.
Pour cette méthode, les tissus sont EpiAirway sevrés de composés anti-microbiens et anti-fongique pour 2 jours avant la livraison, et toutes les procédures sont exécutées sous antibiotique sans conditions. Cela nécessite des considérations spéciales, puisque les bactéries et les principaux tissus humains sont utilisés dans la même armoire de biosécurité, et sont co-cultivées pendant des périodes prolongées.
Protocol
Discussion
Cette méthode permet l'étude de long terme interactions hôte-pathogène dans un contexte biologiquement pertinentes de primaires humains tissus respiratoires à l'interface air-liquide. Ici nous avons utilisé NTHi que l'organisme infectant, mais l'interaction de toute bactérie qui n'introduit pas de cytotoxicité inacceptable au fil du temps peuvent être quantifiés avec cette méthode. Le modèle EpiAirway peut également être utilisé pour l'étude des virus, des drogues ou des produits …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Patrick Hayden (MatTek) pour des discussions utiles, et Robert Smith et Perry Libby de Géorgie Health Sciences University pour leurs compétences EM. Cette étude a été financée par subventions NIDCD DC010187 à la BDCP
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue# | Comments |
|---|---|---|---|
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
Riferimenti
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
