Doğrudan Etkileşim ile 3D Ortak Kültür: Etkileşimlerini İncelemek İçin Kanser Hücrelerini Monositlerle Birlikte Kültleme

1.3D doğrudan etkileşim ile ortak kültürler

1. MRNA ve protein ekspresyonunun analizi için kültürden sonra her hücre soyunun bağımsız olarak sıralanabilmesi için brc hücrelerini ve monositleri hücre kültüründen önce farklı floresan boyalarla etiketle. Canlı hücrelerin hücre zarlarından serbestçe geçen ticari olarak mevcut coumarin ve rhodamine türevlerini kullanın. Etiketleme için genel bir protokol şunlardır:
   1. BrC hücrelerinin tek katmanlısını hazırlayın (25 cm 2 kültür şişesinde² × 10⁶ hücre) ve standart ortamı floresan boyanın yeterli önceden ısıtılmış çalışma çözeltisi ile değiştirin (floresan boyanın 1:2.000'i herhangi bir ek olmadan standart baz ortamda). Nemlendirilmiş %5 CO₂ ortamında 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatır. Boya çözeltisini epire edin ve yeterli 1x PBS ile hafifçe durulayın. PBS'yi aspire edin ve standart ortamı ekleyin.
   2. Hücre monolayerini% 0.05 tripsin çözeltisinin 2 mL'si ve 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca 0.48 mM EDTA ile trypsinize edin. Trypnizasyonu durdurmak için 200 μL FBS ve takviyeler olmadan muhabir ortamının 7 mL'si ekleyin. Hücreleri pipetleme ile yeniden biriktirin. Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 10 μL'lik bir aliquot alın. Hücre sayımından sonra ortak kültür protokolüne devam edin.
   3. RT'de 5 dakika boyunca 430 x g'daki hücreleri peletin (monositler süspansiyonda büyüdüğünden beri bunu ilk kez gerçekleştirin). Floresan boyanın önceden ısıtılmış bir çalışma çözeltisinin 3 mL'si ile süpernatantı atın ve hücreleri hafifçe yeniden biriktirin (floresan boyanın 1:2.000'i takviyesiz standart bir baz ortamda). Nemlendirilmiş % 5 CO₂ ortamında 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.
   4. Hücreleri tekrar pelet, boya çalışma çözeltisini atın ve 5-7 mL 1x PBS ile hafifçe yeniden biriktirin. Pelet bir kez daha, PBS'yi atın ve hücreleri 5-7 mL standart ortamda yeniden biriktirin. Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 10 μL hücre süspansiyonu aliquot alın. Hücre sayımından sonra ortak kültür protokolüne devam edin.
2. Ortak kültürü aşağıdaki gibi ayarlayın: 4 kuyulu bir oda slayt sisteminin her kuyusunda eşit bir katman oluşturacak kadar ECME'yi kuyunun altına yayın. Kuyu başına 5 × 10 5 etiketli BrC hücresi içeren tek hücreli süspansiyonun plakası²⁰ μL.
3. 37 °C'de 15-20 dakikalık inkübasyondan sonra, 80 μL test ortamına^2,5 x 10 5 etiketli monosit süspansiyon ekleyin (%60 ECME ile desteklenmiştir).
4. ECME'nin 37 °C'de 15-20 dakika katılaşmasını sağlar.
5. BrC hücrelerinin ve monosit kültür medyasının 1:1 karışımının 1 mL'sini ekleyin.
6. Farklı zaman noktalarındaki değişiklikleri izlemek için 24 saat, 48 saat veya 5 gün boyunca nemlendirilmiş_%5 CO 2 ortamında 37 °C'de ortak kültürleri kuluçkaya yatırın.
7. Hücreleri kültürlerden kurtarmak için ECM proteinlerini bozun. Ortamı aspire edin ve atın, % 0.1 tripsin ve% 0.25 EDTA ile 1x PBS'nin 0.5 mL'sini ekleyin ve 37 ° C'de 3 saat kuluçkaya yatırın. İnkübasyondan sonra, tripsin nötralize etmek için% 10 FBS ile 1x PBS'nin 0,5 mL'sini ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için kuvvetlice pipetleyarak hücreleri yeniden dürtün.
8. RT'de 5 dakika boyunca 765 x g'da pelet hücreleri, süpernatant atın ve hücreleri% 10 FBS ile 1x PBS'nin 5 mL'sinde yeniden biriktirin. Bu adımı bir kez yineleyin.
9. Hücre süspansiyonu uygun cihazla floresanla etkinleştirilen hücre sıralamaya (FACS) tabi tutulmalıdır. Nihai popülasyonların en az% 95 saf olduğundan emin olun).
10. Sıraladıktan sonra, hücreleri steril 1x PBS, pelet (RT'de 5 dakika boyunca 430 x g) ile yıkayın ve steril 1x PBS'de yeniden biriktirin. Hücreler RNA izolasyonu veya protein analizi için belirli protokollere göre işlenebilir.
11. Her bir hücre soyunun 3D kültürleri de dahil olmak üzere her bir tahlilini kontrol olarak üç kez tekrarlayın.