Co-culture 3D avec interaction directe : co-culture des cellules cancéreuses avec les monocytes pour étudier leur interaction

1.3D co-cultures avec interaction directe

1. Étiquetez les cellules brc et les monocytes avec différents colorants fluorescents avant la culture cellulaire pour permettre un tri indépendant de chaque lignée cellulaire après culture pour l’analyse de l’ARNm et de l’expression protéique. Utilisez des dérivés de la coumarine et de la rhodamine disponibles dans le commerce qui traversent librement la membrane cellulaire des cellules vivantes. Un protocole général d’étiquetage est le suivant :
   1. Préparer un monocouche de cellules BrC d’intérêt (2 × 10⁶ cellules dans un flacon de culture^{de 25 cm 2)} et remplacer le milieu standard par une solution de travail préchauffée suffisante du colorant fluorescent (1:2 000 du colorant fluorescent dans le milieu de base standard sans supplément). Incuber 30 min à 37 °C dans un environnement humidifié de 5 % de CO_2. Aspirer la solution de colorant et rincer doucement avec suffisamment de 1x PBS. Aspirer le PBS et ajouter le support standard.
   2. Essayez de personnaliser le monocouche cellulaire avec 2 mL d’une solution de trypsine de 0,05% et 0,48 mM EDTA pendant 5-10 min à 37 °C. Ajouter 200 μL de FBS pour arrêter la trypsinisation et 7 mL du support correspondant sans suppléments. Resuspendez les cellules par pipetting. Prenez un aliquot de 10 μL pour compter les cellules dans une chambre Neubauer. Continuez avec le protocole de co-culture après le comptage cellulaire.
   3. Pelleter les cellules à 430 x g pendant 5 min à RT (effectuer cette première depuis les monocytes se développent en suspension). Jetez les cellules supernatantes et résuspendez doucement avec 3 mL d’une solution de travail préchauffée du colorant fluorescent (1:2 000 du colorant fluorescent dans un milieu de base standard sans suppléments). Incuber pendant 30 min à 37 °C dans un environnement humidifié de 5 % de CO_2.
   4. Pelleter les cellules à nouveau, jeter la solution de travail colorant, et resuspendre doucement avec 5-7 mL de 1x PBS. Pellet une fois de plus, jeter le PBS, et resuspendre les cellules dans 5-7 mL de milieu standard. Prenez un aliquot de 10 μL de suspension cellulaire pour compter les cellules dans une chambre Neubauer. Continuez avec le protocole de co-culture après le comptage cellulaire.
2. Définissez la co-culture comme suit : répartissez suffisamment d’ECME au fond du puits pour former une couche uniforme dans chaque puits d’un système de glissière de chambre de 4 puits. Plaque 20 μL d’une suspension à cellule unique contenant 5 × 10⁵ cellules BrC étiquetées par puits.
3. Après 15-20 min d’incubation à 37 °C, ajouter une suspension de 2,5 x 10⁵ monocytes étiquetés dans un milieu d’analyse de 80 μL (complété par 60 % d’ECME).
4. Laisser ECME se solidifier pendant 15-20 min à 37 °C.
5. Ajouter 1 mL d’un mélange 1:1 des cellules BrC et des médias de culture des monocytes.
6. Incuber les co-cultures à 37 °C dans un environnement humidifié de CO_{2 à 5} % pendant 24 h, 48 h ou 5 jours pour suivre les changements à différents moments.
7. Dégrader les protéines ECM pour récupérer les cellules des cultures. Aspirer et jeter le milieu, ajouter 0,5 mL de 1x PBS avec 0,1% trypsine et 0,25% EDTA, et incuber pendant 3 h à 37 °C. Après l’incubation, ajouter 0,5 mL de 1x PBS avec 10% de FBS pour neutraliser la trypsine, et resuspendre les cellules en pipetant vigoureusement pour obtenir une suspension à cellule unique.
8. Les cellules de granulés à 765 x g pendant 5 min à RT, jettent le supernatant, et resuspendent les cellules dans 5 mL de 1x PBS avec 10% de FBS. Répétez cette étape une fois.
9. Soumettez la suspension cellulaire au tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) avec l’instrument approprié. Assurez-vous que les populations finales sont au moins 95% pures).
10. Après le tri, laver les cellules avec 1x PBS stérile, granulés (430 x g pendant 5 min à RT), et résuspendre dans stérile 1x PBS. Les cellules peuvent être traitées selon des protocoles spécifiques pour l’isolement de l’ARN ou l’analyse des protéines.
11. Répétez chaque analyse trois fois, y compris les cultures 3D de chaque lignée cellulaire individuelle comme contrôles.