직접적인 상호 작용과 3D 공동 배양: 그들의 상호 작용을 연구하기 위하여 단색세포와 암세포를 공동 배양합니다

직접적인 상호 작용을 가진 1.3D 공동 배양

1. mRNA 및 단백질 발현의 분석을 위한 배양 후 각 세포 계보의 독립적인 분류를 허용하기 위하여 세포 배양 의 앞에 상이한 형광염료를 가진 BrC 세포 및 단핵세포를 레이블. 살아있는 세포의 세포막을 자유롭게 통과하는 쿠마린과 로다민의 상업적으로 이용 가능한 유도체를 사용하십시오. 레이블 지정을 위한 일반적인 프로토콜은 다음과 입니다.
   1. 관심 있는 BrC 세포의 단층(2× 10^6세포 25cm² 배양 플라스크)를 준비하고 표준 배지를 형광염의 충분한 사전 데온 작업 용액으로 대체한다(1:2,000의 형광염은 어떤 보충없이 표준 베이스 배지에서). 가습 5%_CO2 환경에서 37°C에서 30분 배양합니다. 염료 용액을 흡인하고 충분한 1x PBS로 부드럽게 헹구십시오. PBS를 흡인하고 표준 매체를 추가합니다.
   2. 37°C에서 5-10분 동안 0.05% 트립신과 0.48 mM EDTA의 용액2mL로 셀 모노레이어를 트립시니즈. 200 μL의 FBS를 추가하여 트립시니화를 중지하고 보충제없이 특파원 매체의 7 mL을 추가하십시오. 파이펫팅으로 셀을 다시 중단합니다. 10 μL의 알리쿼트를 사용하여 노이바우어 챔버의 세포를 계산합니다. 셀 계수 후 공동 배양 프로토콜을 계속합니다.
   3. RT에서 5 분 동안 430 x g의 세포를 펠렛 (단색세포가 서스펜션에서 자라기 때문에 이 첫 번째 수행). 상체를 버리고 형광염의 사전 따뜻하게 작동 용액의 3 mL로 세포를 부드럽게 재중단하십시오 (보충제없이 표준 기본 배지에서 형광 염료의 1:2,000). 가습 5%_CO2 환경에서 37°C에서 30분 동안 배양한다.
   4. 젤을 다시 펠렛, 염료 작업 용액을 폐기하고 부드럽게 1 x PBS의 5-7 mL로 다시 중단. 펠릿은 다시 한 번 PBS를 폐기하고 표준 배지의 5-7 mL에서 세포를 다시 중단합니다. Neubauer 챔버에서 세포를 계산하기 위해 세포 현탁액의 10 μL의 알리쿼트복용. 셀 계수 후 공동 배양 프로토콜을 계속합니다.
2. 다음과 같이 공동 배양을 설정 : 4 웰 챔버 슬라이드 시스템의 각 웰에 짝수 층을 형성하기 위해 우물의 바닥에 충분한 ECME를 확산. 플레이트 20 μL의 단일 셀 서스펜션은 5 × 10⁵ 라벨BrC 세포를 잘 한다.
3. 37°C에서 15-20분 동안 배양한 후, 80 μL 분석 매체(ECME 60%로 보완)에^2.5 x 10 5 표지된 단핵구의 현탁액을 추가합니다.
4. ECME가 37°C에서 15-20분 동안 응고되도록 허용합니다.
5. BrC 세포와 단핵구 배양 배지의 1:1 혼합의 1mL를 추가합니다.
6. 24시간, 48h, 또는 5일 동안 가습된 5%_CO2 환경에서 37°C에서 공동 배양을 배양하여 서로 다른 시점에서 변화를 추적한다.
7. 배양에서 세포를 복구하기 위해 ECM 단백질을 저하시다. 배지를 흡인 및 폐기하고, 0.1% 트립신과 0.25% EDTA로 1x PBS의 0.5mL를 추가하고, 37°C에서 3시간 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 트립신을 중화시키기 위해 10% FBS로 1x PBS의 0.5mL을 추가하고, 단일 셀 서스펜션을 얻기 위해 적극적으로 배관하여 세포를 재연한다.
8. 펠릿 셀은 765 x g에서 5 분 동안 RT에서 5 분 동안, 상체를 폐기하고 10 % FBS로 1 x PBS의 5 mL에서 세포를 다시 중단합니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
9. 세포 현탁액을 적절한 기기로 형광 활성화 세포 선별(FACS)으로 받침한다. 최종 인구가 95% 이상 순결해야 합니다).
10. 선별 후 멸균 1x PBS, 펠릿(RT에서 5분 동안 430 x g)으로 세포를 세척하고 멸균 1x PBS로 재연합니다. 세포는 RNA 절연 또는 단백질 분석을 위한 특정 프로토콜에 따라 처리될 수 있다.
11. 각 개별 세포 계보의 3D 배양을 포함하여 각 분석서를 세 번 반복합니다.