Co-cultura 3D con interacción directa: co-culturing células cancerosas con monocitos para estudiar su interacción

1.3D co-culturas con interacción directa

1. Etiquete las células BrC y los monocitos con diferentes colorantes fluorescentes antes del cultivo celular para permitir la clasificación independiente de cada linaje celular después del cultivo para el análisis del ARNM y la expresión de proteínas. Utilice derivados disponibles comercialmente de coumarina y rodemina que pasan libremente a través de la membrana celular de las células vivas. Un protocolo general para el etiquetado es el siguiente:
   1. Preparar una monocapa de células brc de interés (2 × 10⁶ células en un matraz de cultivo de 25 cm²⁾ y reemplazar el medio estándar con suficiente solución de trabajo precalentado del tinte fluorescente (1:2,000 del tinte fluorescente en medio base estándar sin ningún suplemento). Incubar 30 min a 37 °C en un ambiente humidificado de 5% CO_2. Aspirar la solución de tinte y enjuagar suavemente con suficiente 1x PBS. Aspirar el PBS y añadir el medio estándar.
   2. Pruebe la monocapa celular con 2 ml de una solución de 0.05% trypsin y 0.48 mM EDTA durante 5-10 min a 37 °C. Añadir 200 μL de FBS para detener la trippsinización y 7 ml del medio corresponsal sin suplementos. Resuspend las células por pipeteo. Tome una alícuota de 10 μL para contar células en una cámara Neubauer. Continúe con el protocolo de co-cultivo después del recuento de celdas.
   3. Peletizar las células a 430 x g durante 5 minutos en RT (realizar este primero ya que los monocitos crecen en suspensión). Deseche las células sobrenadantes y suavemente resuspend con 3 ml de una solución de trabajo pre-calentada del tinte fluorescente (1:2,000 del tinte fluorescente en un medio base estándar sin suplementos). Incubar durante 30 min a 37 °C en un ambiente humidificado de 5% CO_2.
   4. Peletizar las células de nuevo, desechar la solución de trabajo del tinte, y resuspend suavemente con 5-7 mL de 1x PBS. Pellet una vez más, deseche el PBS, y resuspend células en 5-7 mL de medio estándar. Tome una alícuota de 10 μL de suspensión celular para contar células en una cámara Neubauer. Continúe con el protocolo de co-cultivo después del recuento de celdas.
2. Establezca la co-cultura de la siguiente manera: extienda suficiente ECME en la parte inferior del pozo para formar una capa uniforme en cada pozo de un sistema de diapositivas de cámara de 4 pozos. Placa 20 μL de una sola suspensión celular que contiene 5 × 10⁵ células BrC etiquetadas por pozo.
3. Después de 15-20 minutos de incubación a 37 °C, añadir una suspensión de 2,5 x 10⁵ monocitos etiquetados en 80 μL medio de ensayo (complementado con 60% ECME).
4. Permita que ECME se solidifique durante 15-20 min a 37 °C.
5. Agregue 1 ml de una mezcla de 1:1 de las células BrC y los medios de cultivo monocitos.
6. Incubar co-cultivos a 37 °C en un entorno humidificado de 5% CO₂ durante 24 h, 48 h o 5 días para realizar un seguimiento de los cambios en diferentes puntos de tiempo.
7. Degradar las proteínas ECM para recuperar las células de los cultivos. Aspirar y desechar el medio, añadir 0,5 ml de 1x PBS con 0,1% trypsin y 0,25% EDTA, e incubar durante 3 h a 37 °C. Después de la incubación, añadir 0,5 ml de 1x PBS con 10% FBS para neutralizar la trippsina, y resuspend las células pipeteando vigorosamente para obtener una suspensión de una sola célula.
8. Células de pellets a 765 x g durante 5 minutos en RT, desechar el sobrenadante y resuspend las células en 5 ml de 1x PBS con 10% FBS. Repita este paso una vez.
9. Someta la suspensión celular a la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) con el instrumento adecuado. Asegúrese de que las poblaciones finales sean al menos 95% puras).
10. Después de ordenar, lave las células con PBS estéril de 1x, pellet (430 x g durante 5 minutos en RT) y resuspend en PBS estéril de 1x. Las células se pueden procesar de acuerdo con protocolos específicos para el aislamiento del ARN o el análisis de proteínas.
11. Repita cada ensayo tres veces, incluidas las referencias 3D de cada linaje de celda individual como controles.