Summary

Quantification des phénotypes oculaires de Drosophila melanogaster : une approche computationnelle intégrant ilastik et Flynotyper

Published: October 04, 2024
doi:

Summary

Le système oculaire de la drosophile est un outil utile pour étudier divers processus biologiques, en particulier les maladies neurodégénératives humaines. Cependant, la quantification manuelle des phénotypes de l’œil rugueux peut être biaisée et peu fiable. Nous décrivons ici une méthode par laquelle ilastik et Flynotyper sont utilisés pour quantifier le phénotype oculaire de manière non biaisée.

Abstract

L’œil composé de Drosophila melanogaster est un ensemble bien structuré et complet d’environ 800 ommatidies, présentant un motif symétrique et hexagonal. Cette régularité et cette facilité d’observation font du système oculaire de la drosophile un outil puissant pour modéliser diverses maladies neurodégénératives humaines. Cependant, les moyens de quantifier les phénotypes anormaux, tels que le classement manuel des scores de gravité oculaire, ont des limites, en particulier lorsqu’il s’agit de classer les faibles altérations de la morphologie oculaire. Pour pallier ces limitations, des approches computationnelles ont été développées telles que Flynotyper. L’utilisation d’une lumière annulaire permet d’obtenir de meilleures images qualitatives en accédant à l’intégrité des ommatidies individuelles. Cependant, ces images ne peuvent pas être analysées directement par Flynotyper en raison des ombres sur les ommatidies introduites par la lumière annulaire. Ici, nous décrivons une manière impartiale de quantifier les phénotypes de l’œil rugueux observés dans des modèles de maladie de la drosophile en combinant deux logiciels, ilastik et Flynotyper. En prétraitant les images avec ilastik, il est possible de quantifier avec succès le phénotype de l’œil rugueux avec Flynotyper.

Introduction

Le génome de Drosophila melanogaster contient ~75% d’orthologues de gènes liés à des maladies humaines. De plus, au cours du développement de l’œil de la drosophile, environ deux tiers des gènes du génome sont exprimés, ce qui fait de l’œil de la drosophile un système génétique exceptionnel pour l’étude de diverses fonctions moléculaires et cellulaires, du développement et des modèles de maladies 1,2. Ainsi, le système oculaire de la drosophile est un outil expérimental utile pour étudier divers processus biologiques.

L’œil composé de la drosophile est un ensemble bien structuré et complet de ~800 ommatidies qui présentent un motif symétrique et hexagonal3. La régularité de ce motif hexagonal peut être utilisée pour estimer l’effet de l’introduction de mutations et de changements d’expression génique dans la morphologie de l’œil4. Des études antérieures nécessitant une évaluation de la morphologie oculaire se sont fortement appuyées sur le classement manuel de la gravité des phénotypes oculaires détectés à l’œil nu. Pour classer les phénotypes oculaires, des images de la morphologie de l’œil externe sont prises par un stéréomicroscope 5,6. Le phénotype oculaire de chaque groupe est évalué en divisant l’œil externe en quatre zones et en calculant la proportion de dégénérescence dans chaque zone 5,6. Ensuite, les valeurs sont utilisées pour calculer des moyennes qui sont comparées aux valeurs obtenues à partir de mouches témoins7. L’évaluation est basée sur l’étendue de la fusion, la perte d’ommatidies et l’organisation des soies 7,8. Les photos d’yeux de mouches prises au stéréomicroscope sont acquises par un chercheur, et l’analyse du phénotype oculaire est effectuée par un autre chercheur avec des ensembles de validation triples 7,8.

Lorsqu’il s’agit de classer à l’œil nu les faibles altérations de la morphologie de l’œil, il y a des limites4. Pour surmonter ces limitations, des approches informatiques telles que FLEYE et Flynotyper ont été développées 1,9. Flynotyper est une nouvelle méthode de calcul pour estimer quantitativement les changements morphologiques dans le système oculaire de la drosophile1. Il détecte automatiquement l’œil de la drosophile et l’ommatidium individuel, en calculant les scores phénotypiques (P-Scores) basés sur l’irrégularité del’œil1. Un P-Score plus élevé indique que l’œil de la mouche est plus dégénéré. Ce logiciel a été utilisé avec succès pour quantifier l’anomalie des yeux de la drosophile 10. Bien que Flynotyper garantisse un processus automatisé, il ne peut toujours pas être appliqué avec succès à certaines images oculaires prises par diverses méthodes de microscopie optique.

D’un point de vue qualitatif, nous préférons une source lumineuse annulaire par rapport à une source lumineuse à point unique, car elle offre une représentation plus précise de chaque ommatidium. Cependant, lorsque la lumière annulaire est utilisée, elle génère une ombre en forme d’anneau au sommet de chaque ommatidium en raison de la forme hémisphérique de l’ommatidium. Cette ombre en forme d’anneau empêche la détection précise de l’ommatidium par Flynotyper, ce qui entraîne un calcul incorrect des P-Scores.

Pour surmonter ces problèmes, nous avons mis en œuvre ilastik, un outil basé sur l’apprentissage automatique pour diverses analyses, afin de classer les ommatidies dans les images d’yeux de mouche11. Nous avons ensuite introduit les images générées par ilastik dans Flynotyper pour calculer les P-Scores. Cela nous permet de quantifier les défauts morphologiques de l’œil de la drosophile de manière impartiale1.

Protocol

1. Préparation à la quantification Téléchargez et installez ilastik11, ImageJ et le plugin ImageJ Flynotyper1. Voir la table des matériaux pour les liens du site Web vers l’installation. Téléchargez les packages appropriés en fonction du système d’exploitation de l’ordinateur (Mac, Windows, Linux, etc.). Suivez les instructions d’installation à la lettre comme indiqué.REMARQ…

Representative Results

Dans une étude précédente, nous avons utilisé ce protocole pour déterminer les modificateurs génétiques de la protéine VCP mutante liée à la sclérose latérale amyotrophique avec démence frontotemporale (ALS-FTD)12. De plus, cette méthode a également été utilisée dans un autre article pour évaluer la toxicité de CHCHD10 ALS-FTD médiée parS59L, même lors de l’utilisation d’un stéréomicroscope plus ancien13</s…

Discussion

Les ommatidies de la drosophile constituent un système utile pour l’étude de diverses fonctions biologiques et maladies génétiques. La régularité des ommatidies est une bonne mesure pour examiner l’effet des mutations génétiques4. Même s’il existe plusieurs méthodes de calcul de la régularité ommatidienne, telles que le classement manuel, ces méthodes peuvent être fortement biaisées. Pour surmonter cette approche biaisée, des outils …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Pedro Fernandez-Funez pour l’utilisation du microscope et de la caméra utilisés dans ce protocole. Nous tenons également à remercier Ava Schapman de nous avoir fait part de ses commentaires sur la clarté du protocole. Le soutien financier a été fourni par le Wallin Neuroscience Discovery Fund à Nam Chul Kim.

Materials

Computer specifications Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper Iyer, J. et al. (2016) Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik Berg, S. et al. (2019) Download software here: https://www.ilastik.org/download.html Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ Download software here: https://imagej.net/ij/download.html Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X) Leica Microsystems LASX Office 1.4.6 28433 System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera Leica Microsystems 10 447 173, 12 730 466 Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.

References

  1. Iyer, J., et al. Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster. G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).
  2. Thomas, B. J., Wassarman, D. A. A fly’s eye view of biology. Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).
  3. Roignant, J. -. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).
  4. Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model. Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).
  5. Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates. Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).
  6. Pandey, U. B., et al. HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).
  7. Outa, A. A., et al. Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening. Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).
  8. Shirinian, M., et al. A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo. J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).
  9. Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model. Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).
  10. Yusuff, T., et al. Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development. PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).
  11. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).
  12. Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model. BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).
  13. Baek, M., et al. TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro. Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).

Play Video

Citer Cet Article
Mujteba, Q., Chalmers, M. R., Kim, J., Baek, M., Kim, N. C. Quantifying Drosophila melanogaster Eye Phenotypes: A Computational Approach Integrating ilastik and Flynotyper. J. Vis. Exp. (212), e67219, doi:10.3791/67219 (2024).

View Video