El sistema ocular de Drosophila es una herramienta útil para estudiar diversos procesos biológicos, en particular las enfermedades neurodegenerativas humanas. Sin embargo, la cuantificación manual de los fenotipos de ojos ásperos puede ser sesgada y poco fiable. Aquí describimos un método por el cual ilastik y Flynotyper se utilizan para cuantificar el fenotipo del ojo de una manera imparcial.
El ojo compuesto de Drosophila melanogaster es una gama bien estructurada y completa de alrededor de 800 omatidios, que exhiben un patrón simétrico y hexagonal. Esta regularidad y facilidad de observación hacen del sistema ocular de Drosophila una poderosa herramienta para modelar diversas enfermedades neurodegenerativas humanas. Sin embargo, las formas de cuantificar los fenotipos anormales, como la clasificación manual de las puntuaciones de gravedad ocular, tienen limitaciones, especialmente cuando se clasifican las alteraciones débiles en la morfología del ojo. Para superar estas limitaciones, se han desarrollado enfoques computacionales como Flynotyper. El uso de un anillo de luz permite obtener mejores imágenes cualitativas accediendo a la integridad de los omatidios individuales. Sin embargo, estas imágenes no pueden ser analizadas por Flynotyper directamente debido a las sombras en los omatidios introducidas por el anillo de luz. Aquí, describimos una forma imparcial de cuantificar los fenotipos de ojos ásperos observados en modelos de enfermedad de Drosophila mediante la combinación de dos software, ilastik y Flynotyper. Al preprocesar las imágenes con ilastik, se puede lograr una cuantificación exitosa del fenotipo del ojo rugoso con Flynotyper.
El genoma de Drosophila melanogaster contiene ~75% de ortólogos genéticos relacionados con enfermedades humanas. Además, durante el desarrollo del ojo de Drosophila, se expresan aproximadamente dos tercios de los genes del genoma, lo que convierte al ojo de Drosophila en un sistema genético excepcional para investigar diversas funciones moleculares y celulares, desarrollo y modelos de enfermedades 1,2. Por lo tanto, el sistema ocular de Drosophila es una herramienta experimental útil para estudiar diversos procesos biológicos.
El ojo compuesto de Drosophila es una matriz bien estructurada y completa de ~ 800 omatidios que exhiben un patrón simétrico y hexagonal3. La regularidad de este patrón hexagonal se puede utilizar para estimar el efecto de la introducción de mutaciones y cambios en la expresión génica en la morfología del ojo4. Los estudios previos que requieren la evaluación de la morfología del ojo se han basado en gran medida en la clasificación manual de la gravedad de los fenotipos del ojo detectados a simple vista. Para clasificar los fenotipos oculares, las imágenes de la morfología externa del ojo se toman con un microscopio estereoscópico 5,6. El fenotipo ocular de cada grupo se evalúa dividiendo el ojo externo en cuatro áreas y calculando la proporción de degeneración en cada área 5,6. A continuación, los valores se utilizan para calcular promedios que se comparan con los valores obtenidos de las moscas de control7. La puntuación se basa en el grado de fusión, la pérdida de omatidios y la organización de las cerdas 7,8. Las fotos de ojo de mosca tomadas con un microscopio estereoscópico son adquiridas por un investigador, y el análisis del fenotipo del ojo es realizado por otro investigador con conjuntos de triple validación 7,8.
A simple vista se trata de clasificar las alteraciones débiles en la morfología del ojo, existen limitaciones4. Para superar estas limitaciones, se han desarrollado enfoques computacionales como FLEYE y Flynotyper 1,9. Flynotyper es un nuevo método computacional para estimar cuantitativamente los cambios morfológicos en el sistema ocular de Drosophila1. Detecta automáticamente el ojo de Drosophila y el omatridio individual, calculando las puntuaciones fenotípicas (puntuaciones P) en función de la irregularidad delojo1. Una puntuación P más alta indica que el ojo de la mosca está más degenerado. Este software se utilizó con éxito para cuantificar la anormalidad de los ojos de Drosophila 10. Aunque Flynotyper garantiza un proceso automatizado, todavía no se puede aplicar con éxito a algunas imágenes oculares tomadas por varios métodos de microscopía óptica.
Cualitativamente, preferimos una fuente de luz anular en comparación con una fuente de luz de un solo punto, ya que ofrece una representación más precisa de cada omatidio. Sin embargo, cuando se utiliza el anillo de luz, genera una sombra en forma de anillo en la parte superior de cada omatidio debido a la forma semiesférica del omatidio. Esta sombra en forma de anillo inhibe la detección omatidial precisa por parte de Flynotyper, lo que lleva a un cálculo incorrecto de las puntuaciones P.
Para superar estos problemas, implementamos ilastik, una herramienta basada en el aprendizaje automático para varios análisis, para clasificar omatidios en imágenes de ojo de mosca11. A continuación, introducimos las imágenes generadas por ilastik en Flynotyper para calcular las puntuaciones P. Esto nos permite cuantificar los defectos morfológicos del ojo de Drosophila de forma imparcial1.
Los omatidios de Drosophila constituyen un sistema útil para el estudio de diversas funciones biológicas y enfermedades genéticas. La regularidad de los omatidios es una buena medida para examinar el efecto de las mutaciones genéticas4. Aunque existen varios métodos para calcular la regularidad omatidial, como la clasificación manual, estos métodos pueden estar muy sesgados. Para superar este enfoque sesgado, se han desarrollado herramientas semiau…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Pedro Fernández-Fúnez el uso del microscopio y la cámara utilizada en este protocolo. También nos gustaría agradecer a Ava Schapman por proporcionar comentarios sobre la claridad del protocolo. El apoyo financiero fue proporcionado por The Wallin Neuroscience Discovery Fund a Nam Chul Kim.
Computer specifications | Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10 | ||
Flynotyper | Iyer, J. et al. (2016) | Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html | Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper. |
ilastik | Berg, S. et al. (2019) | Download software here: https://www.ilastik.org/download.html | Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system. |
ImageJ | Download software here: https://imagej.net/ij/download.html | Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download. | |
Leica Application Suite (LAS X) | Leica Microsystems | LASX Office 1.4.6 28433 | System and software used for z-stack acquisition. |
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera | Leica Microsystems | 10 447 173, 12 730 466 | Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived. |