Das Drosophila-Augensystem ist ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse, insbesondere bei neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen. Die manuelle Quantifizierung von Phänotypen des rauen Auges kann jedoch verzerrt und unzuverlässig sein. Hier beschreiben wir eine Methode, mit der Ilastik und Flynotyper verwendet werden, um den Augenphänotyp unvoreingenommen zu quantifizieren.
Das Facettenauge Drosophila melanogaster ist ein gut strukturiertes und umfassendes Array von etwa 800 Ommatidien, das ein symmetrisches und hexagonales Muster aufweist. Diese Regelmäßigkeit und einfache Beobachtung machen das Drosophila-Augensystem zu einem leistungsfähigen Werkzeug zur Modellierung verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen des Menschen. Methoden zur Quantifizierung abnormaler Phänotypen, wie z. B. die manuelle Einstufung von Augenschweregraden, haben jedoch Grenzen, insbesondere bei der Einstufung schwacher Veränderungen in der Augenmorphologie. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden computergestützte Ansätze wie Flynotyper entwickelt. Die Verwendung eines Ringlichts ermöglicht qualitativ bessere Bilder, die auf die Unversehrtheit der einzelnen Ommatidien zugreifen. Diese Bilder können jedoch nicht direkt von Flynotyper analysiert werden, da das Ringlicht Schatten auf Ommatidien wirft. Hier beschreiben wir eine unvoreingenommene Methode zur Quantifizierung von rauen Augenphänotypen, die in Drosophila-Krankheitsmodellen beobachtet wurden, durch die Kombination von zwei Softwares, ilastik und Flynotyper. Durch die Vorverarbeitung der Bilder mit Ilastik kann eine erfolgreiche Quantifizierung des rauen Augenphänotyps mit Flynotyper erreicht werden.
Das Genom von Drosophila melanogaster enthält ~75% der menschlichen krankheitsbezogenen Gen-Orthologe. Darüber hinaus werden während der Entwicklung des Drosophila-Auges etwa zwei Drittel der Gene im Genom exprimiert, was das Drosophila-Auge zu einem hervorragenden genetischen System macht, um verschiedene molekulare und zelluläre Funktionen, Entwicklungs- und Krankheitsmodelle zu untersuchen 1,2. Somit ist das Drosophila-Augensystem ein nützliches experimentelles Werkzeug, um verschiedene biologische Prozesse zu untersuchen.
Das Drosophila-Facettenauge ist ein gut strukturiertes und umfassendes Array von ~800 Ommatidien, die ein symmetrisches und sechseckiges Muster aufweisen3. Die Regelmäßigkeit dieses hexagonalen Musters kann verwendet werden, um den Effekt der Einführung von Mutationen und Veränderungen der Genexpression in der Augenmorphologie abzuschätzen4. Frühere Studien, die eine Bewertung der Augenmorphologie erfordern, haben sich stark auf eine manuelle Einstufung des Schweregrads von Augenphänotypen verlassen, die mit bloßem Auge erkannt wurden. Um die Augenphänotypen zu ordnen, werden externe Bilder der Augenmorphologie mit einem Stereomikroskop aufgenommen 5,6. Der Augenphänotyp jeder Gruppe wird beurteilt, indem das äußere Auge in vier Bereiche aufgeteilt und der Anteil der Degeneration in jedem Bereich berechnetwird 5,6. Dann werden die Werte verwendet, um Durchschnittswerte zu berechnen, die mit den Werten verglichen werden, die aus Kontrollfliegen7 erhalten wurden. Die Bewertung basiert auf dem Ausmaß der Fusion, dem Verlust von Ommatidien und der Borstenorganisation 7,8. Mit einem Stereomikroskop aufgenommene Fliegenaugenfotos werden von einem Forscher aufgenommen, und die Augenphänotypanalyse wird von einem anderen Forscher mit dreifachen Validierungssätzen 7,8 durchgeführt.
Wenn es darum geht, schwache Veränderungen in der Augenmorphologie mit bloßem Auge zu bewerten, gibt es Einschränkungen4. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden computergestützte Ansätze wie FLEYE und Flynotyper entwickelt 1,9. Flynotyper ist eine neuartige Berechnungsmethode zur quantitativen Abschätzung morphologischer Veränderungen im Drosophila-Augensystem1. Es erkennt automatisch das Drosophila-Auge und das einzelne Ommatidium und berechnet phänotypische Scores (P-Scores) basierend auf der Unregelmäßigkeit desAuges1. Ein höherer P-Score deutet darauf hin, dass das Fliegenauge stärker degeneriert ist. Diese Software wurde erfolgreich bei der Quantifizierung der Anomalie von Drosophila-Augen eingesetzt10. Obwohl Flynotyper einen automatisierten Prozess gewährleistet, kann er immer noch nicht erfolgreich auf einige Augenbilder angewendet werden, die mit verschiedenen lichtmikroskopischen Methoden aufgenommen wurden.
Qualitativ bevorzugen wir eine Ringlichtquelle im Vergleich zu einer Einzelpunkt-Lichtquelle, da sie eine genauere Darstellung jedes Ommatidiums bietet. Wenn jedoch das Ringlicht verwendet wird, erzeugt es aufgrund der halbkugelförmigen Form des Ommatidiums einen ringförmigen Schatten an der Spitze jedes Ommatidiums. Dieser ringförmige Schatten verhindert die genaue Erkennung von Ommatiden durch Flynotyper, was zu einer falschen Berechnung der P-Scores führt.
Um diese Probleme zu lösen, haben wir ilastik implementiert, ein auf maschinellem Lernen basierendes Tool für verschiedene Analysen, um Ommatidien in Fliegenaugenbildern zu klassifizieren11. Die von Ilastik generierten Bilder speisten wir dann in Flynotyper ein, um die P-Scores zu berechnen. Dies ermöglicht es uns, die morphologischen Defekte des Drosophila-Auges unvoreingenommen zu quantifizieren1.
Die Ommatidien von Drosophila stellen ein nützliches System zur Untersuchung verschiedener biologischer Funktionen und genetischer Krankheiten dar. Die Regelmäßigkeit von Ommatidien ist ein gutes Maß, um die Wirkung genetischer Mutationen zu untersuchen4. Obwohl es mehrere Methoden zur Berechnung der ommatidialen Regelmäßigkeit gibt, wie z. B. das manuelle Ranking, können diese Methoden stark verzerrt sein. Um diesen verzerrten Ansatz zu überwinde…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Pedro Fernandez-Funez für die Verwendung des Mikroskops und der Kamera, die in diesem Protokoll verwendet werden. Wir möchten uns auch bei Ava Schapman für ihr Feedback zur Klarheit des Protokolls bedanken. Finanzielle Unterstützung erhielt Nam Chul Kim durch den Wallin Neuroscience Discovery Fund.
Computer specifications | Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10 | ||
Flynotyper | Iyer, J. et al. (2016) | Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html | Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper. |
ilastik | Berg, S. et al. (2019) | Download software here: https://www.ilastik.org/download.html | Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system. |
ImageJ | Download software here: https://imagej.net/ij/download.html | Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download. | |
Leica Application Suite (LAS X) | Leica Microsystems | LASX Office 1.4.6 28433 | System and software used for z-stack acquisition. |
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera | Leica Microsystems | 10 447 173, 12 730 466 | Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived. |