Summary

Essai de réassemblage de la luciférase fractionnée pour mesurer les contacts du réticulum endoplasmique et des mitochondries dans des cellules vivantes

Published: October 11, 2024
doi:

Summary

Nous avons mis au point un test de réassemblage de la luciférase fractionnée pour surveiller les contacts réticulum-mitochondrie endoplasmique dans les cellules vivantes. À l’aide de ce test, nous décrivons un protocole permettant de mesurer quantitativement le niveau de ces couplages inter-organites dans HEK293T cellules, dans des conditions de traitement chimique.

Abstract

Les sites de contact du réticulum endoplasmique (RE)-mitochondries jouent un rôle essentiel dans la santé cellulaire et l’homéostasie, tels que la régulation du Ca2+ et de l’homéostasie lipidique, la dynamique mitochondriale, la biogenèse des autophagosomes et des mitophagosomes et l’apoptose. L’incapacité à maintenir un couplage ER-mitochondrial, normal, est impliquée dans de nombreuses maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique et la paraplégie spastique héréditaire. Il est d’une importance considérable d’explorer comment la dérégulation des contacts mitochondriaux RE pourrait conduire à la mort cellulaire et si la réparation de ces contacts à un niveau normal pourrait améliorer les conditions neurodégénératives. Ainsi, des tests améliorés qui mesurent le niveau de ces contacts pourraient aider à éclairer les mécanismes pathogènes de ces maladies. À terme, la mise en place de dosages simples et fiables facilitera le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous décrivons ici un test de luciférase fractionnée pour mesurer quantitativement le niveau de contacts entre les mitochondries du RE et les cellules vivantes. Ce test peut être utilisé pour étudier le rôle physiopathologique de ces contacts ainsi que pour identifier leurs modulateurs dans le criblage à haut débit.

Introduction

Les interactions entre le RE et les mitochondries sont vitales pour l’homéostasie cellulaire et la survie 1,2,3,4. Des preuves antérieures indiquent que tout type de perturbation ou de dérégulation des sites de contact entre les mitochondries du RE peut contribuer à plusieurs maladies neurodégénératives, métaboliques et cardiovasculaires, ainsi qu’au cancer 5,6,7,8,9,10. Par exemple, une augmentation anormale de l’absorption de Ca2+ dans les mitochondries peut entraîner la mort cellulaire en ouvrant les pores de transition de perméabilité des mitochondries, qui sont couramment observés dans certains modèles de la maladie d’Alzheimer 5,11. De même, la réduction des contacts entre les mitochondries du RE peut entraîner une diminution de la production d’ATP et une altération de l’apport en Ca2+, comme on l’a vu dans des modèles de sclérose latérale amyotrophique 5,11,12. Au fur et à mesure que de plus en plus d’études sont menées dans le domaine des contacts RE-mitochondries, d’autres protéines et gènes liés à la maladie qui pourraient affecter ces contacts sont découverts. Malgré les connaissances actuelles et les preuves montrant le rôle des sites de contact RE-mitochondries, beaucoup de travail reste encore à faire pour élucider comment ces contacts pourraient entraîner une perte de fonction cellulaire et, en fin de compte, la mort cellulaire.

Diverses méthodes ont été développées pour évaluer la proximité des deux membranes, la morphologie structurelle et la distance entre les deux sites de contact des organites 3,4,13. Les approches de surveillance du couplage RE-mitochondries comprennent l’imagerie basée sur des marqueurs de fluorescence14,15, l’imagerie basée sur le rapporteur FRET16 et l’imagerie basée sur une sonde de fluorescence divisée17,18, qui utilisent l’épifluorescence et la microscopie confocale. La microscopie à super-résolution et la microscopie à résolution atomique sont également des outils puissants pour visualiser avec précision les contacts entre organites, bien que leur utilisation dans l’analyse des sites de contact soit encore limitée car elles nécessitent des microscopes hautement dédiés et une expertise technique19. De plus, la microscopie électronique à transmission (MET), la microscopie électronique à balayage (MEB) et d’autres techniques EM telles que la tomographie électronique (TE) et la cryomicroscopie électronique sont couramment utilisées car elles fournissent une imagerie ultrastructurale à haute résolution des sites de contact, qui sont souvent impossibles à explorer à l’aide d’autres approches expérimentales 20,21,22. Cependant, ces méthodes basées sur les EM sont une technique à très faible débit qui peut également être affectée par les procédures de fixation chimique. Plus récemment, des méthodes basées sur le marquage de proximité ont été utilisées pour détecter les sites de contact ainsi que pour identifier de nouvelles protéines de site de contact. Par exemple, le test de ligature de proximité (PLA) a été utilisé pour quantifier la proximité des organites23,24, tandis qu’une version révisée du test de l’ascorbate peroxydase (APEX) a été utilisée pour identifier de nouvelles protéines de site de contact25,26. Il est important de reconnaître que toutes ces méthodes décrites ci-dessus ont des forces et des limites intrinsèques dans la détection des contacts entre les organites. Ainsi, l’appariement de différentes techniques est nécessaire pour obtenir une interprétation approfondie des sites de contact des organites.

Auparavant, nous avons établi le test de réassemblage de la Renilla luciférase 8 (test Split-Rluc) pour surveiller le niveau de contacts membranaires des mitochondries du RE (Figure 1A)24,26,27. En bref, chaque moitié fendue de Renilla luciferase est conjuguée à une séquence ciblant le RE ou les mitochondries. Lorsqu’elle est transfectée ensemble, chaque moitié fendue de l’enzyme est exprimée soit dans le RE, soit dans la membrane mitochondriale. Lorsque le RE et les mitochondries sont positionnés à proximité l’une de l’autre, les moitiés fendues se rejoignent et reconstituent l’ensemble de l’enzyme avec l’activité de la luciférase. Pour la construction split-Rluc, nous avons utilisé Renilla luciferase 8 (Rluc8) dans pBAD/Myc-His27 pour le modèle initial. Le site de division (entre les acides aminés 91 et 92) a été déterminé sur la base des rapports précédents27. Pour la moitié N-terminale du Rluc8, les séquences d’ADN des acides aminés 1-91 du Rluc8 ont été fusionnées à l’extrémité 3′ de l’étiquette FLAG et à la séquence de ciblage mitochondriale AKAP1 de la souris dans le vecteur TOPO pcDNA3.1 par PCR27. Pour la moitié C-terminale ciblée sur le RE, les séquences d’ADN qui codent pour les acides aminés 92-311 ont été fusionnées à l’extrémité 5′ de l’étiquette myc et à la séquence de localisation du RE UBC6 de la levure. Ici, nous avons mis à niveau la construction du plasmide luc split-Rde sorte que les moitiés fendues de la Renilla luciferase sont exprimées dans un seul vecteur (pCAG) sous le même promoteur, puis clivées en deux fragments lorsque T2A, une séquence 2A du peptide 2A auto-clivant du virus Thosea asigna, est insérée entre les deux moitiés divisées (Figure 1B). La carte et les séquences de l’ADN plasmidique sont fournies dans le fichier supplémentaire 1 et la figure supplémentaire S1. À l’aide de ce système, nous avons mesuré les effets de trois substances chimiques (inhibitrices des GTPases impliquées dans la polymérisation de l’actine) sur les contacts RE-mitochondries. Ce test luc split-Rest un système de test simple mais robuste pour le criblage à haut débit de modulateurs de contact inter-organites24.

Protocol

1. Entretien des cellules et ensemencement (Jour 1) Conserver HEK293T cellules dans un milieu de culture cellulaire contenant du milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) (dans des boîtes de culture de 100 mm) dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2. Avant de commencer, vérifiez la confluence de la plaque en l’observant au microscope. Lorsque les cellules atteignent environ 80 à 90 …

Representative Results

Nous avons utilisé le protocole décrit ci-dessus pour mesurer le niveau de contacts RE-mitochondries lors de l’ajout de trois composés connus pour inhiber des GTPases spécifiques. CDC42, RHO et RAC sont des GTPases qui favorisent la polymérisation de l’actine28 lorsqu’elles sont activées et sont inhibées par ZCL278, Rhosine et Ehop-016, respectivement24. HEK293T cellules transfectées avec split-Rluc ont été traitée…

Discussion

Nous avons utilisé un test de réassemblage de la luciférase 8 de Renilla fendue (test R luc split-R) pour quantifier le niveau de couplages RE-mitochondries. Dans cette étude, nous avons modifié la construction originale de Split-Rluc24 en générant un seul vecteur, pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc CER-IRES-mCherry, codant chaque composant de Split-Rluc (MitoRlucN et Rluc<…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le Dr Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) pour l’examen critique du manuscrit. Ces travaux ont été financés en partie par le National Institute of Neurological Disease and Stroke (NINDS, R01NS113516).

Materials

1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube Sorenson 16070
6-well plate TC Treated USA Scientific CC7682-7506
10 mL Pipette Tips OneTip USA Scientific 1110-3700
10 μL pipette tips OneTip USA Scientific 1110-3700
20-200 μL Beveled tips OneTip USA Scientific 1111-1210
50 mL Polypropylene Conical Tube Falcon 352070
96-Well Flipper Microtube Racks ThermoFisher Scientific 8770-11
96-well plate TC Treated  USA Scientific CC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Treated Dish USA Scientific CC7682-3394
1250 μL Tips OneTip USA Scientific 1112-1720
Centrifuge 5910 Ri – Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5943000131
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9% Sigma-Aldrich 276855-100ML
DMEM, high glucose ThermoFisher Scientific 11965092
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14190144
EHop 016 Bio-Techne Tocris 6248 Dissolve in DMSO; store at -70 °C
EnduRen Live Cell Substrate Promega E6481 Store aliquots at -70 °C
Eppendorf 2-20 μL pipette Eppendorf 3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipette Eppendorf 3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipette Eppendorf 3123000020
Eppendorf Research plus 12-channel Eppendorf 3125000028
Eppendorf Research plus 200 μL pipette Eppendorf  3123000055
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions ThermoFisher Scientific 10437028
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 381
Hand tally counter Sigma-Aldrich HS6594
HEK 293T Cells ATCC CRL-3216
Hemacytometer – Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber LW Scientific CTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE Buffer ThermoFisher Scientific 8019005
Microscope Zeiss Axiovert 25 CFL
Mini centrifuge Benchmark Scientific C1012
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge Tubes Boekel Scientific 120008
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) Polysciences 24765-100MG
Pipet-Aid XP USA Scientific 4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P6407-5MG
Rhosin hydrochloride Bio-Techne Tocris 5003 Dissolve in DMSO; store at -70 °C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300054
Varioskan LUX multimode microplate reader ThermoFisher Scientific VL0000D0
Vortex ThermoFisher Scientific 2215365 level 8
VWR Vacuum Aspiration System VWR 75870-734
ZCL 278 Bio-Techne Tocris 4794 Dissolve in DMSO; store at -70 °C

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Citer Cet Article
Chen, C., Rafael, K. A., Cho, G., Lim, Y. Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells. J. Vis. Exp. (212), e66862, doi:10.3791/66862 (2024).

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