概要

生細胞における小胞体-ミトコンドリア接触を測定するためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイ

Published: October 11, 2024
doi:

概要

私たちは、生細胞の小胞体-ミトコンドリア接触をモニターするためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイを確立しました。このアッセイを用いて、化学処理の条件下で、HEK293T細胞内のこれらのオルガネラ間カップリングのレベルを定量的に測定するプロトコールを記載します。

Abstract

小胞体(ER)-ミトコンドリア接触部位は、Ca2+ および脂質恒常性の調節、ミトコンドリアダイナミクス、オートファゴソームおよびミトファゴソームの生合成、アポトーシスなど、細胞の健康および恒常性において重要な役割を果たします。正常なERとミトコンドリアの結合を維持できないことは、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、遺伝性痙性対麻痺など、多くの神経変性疾患に関与しています。ERとミトコンドリアの接触の調節不全がどのように細胞死につながるか、そしてこれらの接触を正常なレベルに修復することで神経変性疾患を改善できるかどうかを調査することは非常に重要です。したがって、これらの接触のレベルを測定する改良されたアッセイは、これらの疾患の病原性メカニズムを明らかにするのに役立つ可能性があります。最終的には、シンプルで信頼性の高いアッセイを確立することで、新しい治療戦略の開発が容易になります。ここでは、生細胞内のER-ミトコンドリア接触レベルを定量的に測定するためのスプリットルシフェラーゼアッセイについて説明します。このアッセイは、これらの接触の病態生理学的役割を研究するためだけでなく、ハイスループットスクリーニングにおけるそれらのモジュレーターの同定にも使用できます。

Introduction

小胞体とミトコンドリアとの間の相互作用は、細胞の恒常性と生存に不可欠です1,2,3,4。以前の証拠は、ER-ミトコンドリア接触部位におけるあらゆる種類の混乱または調節不全が、いくつかの神経変性疾患、代謝性疾患、および心血管疾患、ならびに癌5,6,7,8,9,10に寄与する可能性があることを示しています。例えば、ミトコンドリアへのCa2+の取り込みが異常に増加すると、アルツハイマー病の一部のモデルでよく見られるミトコンドリア透過性遷移孔が開き、細胞死につながる可能性があります5,11。同様に、ERとミトコンドリアの接触の減少は、筋萎縮性側索硬化症のモデルに見られるように、ATP産生の減少とCa2+摂取の障害をもたらす可能性があります5,11,12。ERとミトコンドリアの接触の領域でより多くの研究が行われるにつれて、これらの接触に影響を与える可能性のある追加の疾患関連タンパク質と遺伝子が発見されています。ERとミトコンドリアの接触部位の役割を示す現在の知識と証拠にもかかわらず、これらの接触がどのように細胞機能の喪失、そして最終的には細胞死につながるかを解明するには、まだ多くの研究が必要です。

2つの膜の近接性、構造形態、および2つの細胞小器官接触部位3,4,13間の距離を評価するために、さまざまな方法が開発されてきました。ER-ミトコンドリア結合をモニターするアプローチには、蛍光マーカーベースのイメージング14,15、FRETレポーターベースのイメージング16、および分外蛍光プローブベースのイメージング17,18が含まれ、落射蛍光および共焦点顕微鏡を使用する。超解像顕微鏡法および原子分解能顕微鏡法も、オルガネラ間接触を正確に視覚化するための強力なツールであるが、接触部位分析におけるそれらの利用は、高度に専用の顕微鏡と技術的専門知識を必要とするため、依然として限られている19。さらに、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)、および電子線トモグラフィー(ET)やクライオ電子顕微鏡などの他のEM技術は、接触部位の高解像度の超微細構造イメージングを提供するため、一般的に使用されていますが、これは他の実験的アプローチでは探索が不可能なことが多い20,21,22。.しかし、これらのEMベースの方法は、非常にロースループットの手法であり、化学固定手順の影響も受ける可能性があります。最近では、近接ラベリングベースの方法を使用して、接触部位を検出したり、新しい接触部位タンパク質を同定したりしています。例えば、近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、オルガネラの近接性を定量するために使用されてきた23,24一方、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX)アッセイの改訂版は、新しい接触部位タンパク質の同定に利用されてきた25,26。上記のすべての方法には、オルガネラ間の接触を検出する上で長所と固有の制限があることを認識することが重要です。したがって、オルガネラ接触部位の徹底的な解釈を得るためには、異なる技術の組み合わせが必要です。

以前に、ERミトコンドリア膜接触のレベルを監視するために、split-Renillaルシフェラーゼ8再構成アッセイ(split-Rlucアッセイ)を確立しました(図1A)24,26,27。簡単に言うと、Renillaルシフェラーゼの各分割された半分は、ERまたはミトコンドリアの標的配列と結合されています。一緒にトランスフェクトすると、酵素の各分割された半分はERまたはミトコンドリア膜のいずれかで発現します。ERとミトコンドリアが互いに近接して配置されると、分割された半分が一緒になり、ルシフェラーゼ活性を持つ酵素全体が再構成されます。split-Rluc コンストラクトでは、初期テンプレートに pBAD/Myc-His27Renilla luciferase 8 (Rluc8) を使用しました。分裂部位(アミノ酸91と92の間)は、以前の報告27に基づいて決定された。Rluc8のN末端半分については、PCR27により、R luc8のアミノ酸1-91のDNA配列をFLAGタグの3’末端とマウスAKAP1ミトコンドリア標的配列のpcDNA3.1 TOPOベクターに融合させた。小胞体を標的とするC末端の半分については、アミノ酸92-311をコードするDNA配列をmycタグの5’末端と酵母UBC6 ER局在配列に融合させた。ここでは、Renillaルシフェラーゼの分割半分が同じプロモーターの下で単一ベクター(pCAG)で発現し、その後、Thosea asignaウイルス由来の自己切断ペプチド2A配列であるT2Aが2つの分割半分の間に挿入されるときに2つのフラグメントに切断されるように、split-R lucプラスミドコンストラクトをアップグレードしました(図1B)。プラスミドDNAマップおよび配列は、補足ファイル1および補足図S1に記載されています。このシステムを用いて、3つの化学物質(アクチン重合に関与するGTPaseを阻害する物質)がER-ミトコンドリアの接触に及ぼす影響を測定しました。このsplit-Rlucアッセイは、細胞小器官間接触モジュレーター24のハイスループットスクリーニングのためのシンプルでありながら堅牢なアッセイシステムです。

Protocol

1. 細胞の維持と播種(1日目) HEK293T細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)(100 mm培養皿)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む細胞培養培地で、37°C、5%CO2の加湿インキュベーターで維持します。 開始する前に、顕微鏡で観察してプレートの合流点を確認してください。細胞が約80〜90%の密度に達したら、培地を取り出し、10 mLのダルベッ…

Representative Results

我々は、上記のプロトコルを使用して、特定のGTPaseを阻害することが知られている3つの化合物を添加したときのER-ミトコンドリア接触のレベルを測定しました。CDC42、RHO、およびRACは、活性化されるとアクチン重合28を促進するGTPアーゼであり、それぞれZCL278、Rhosin、およびEhop-016によって阻害される24。split-Rlucでトランス?…

Discussion

私たちは、ER-ミトコンドリアカップリングのレベルを定量するために、split-Renillaルシフェラーゼ8再構成アッセイ(split-Rlucアッセイ)を使用しました。本研究では、ルシフェラーゼの各分割半分が同量の発現を確保するために、各split-Rluc成分(MitoRlucNおよびRlucCER)およびThosea asignaウイルス由来の自己切断ペプチド2…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、原稿の批判的なレビューについて、Jeffrey Golden博士(Cedars-Sinai Medical Center)に感謝しています。この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(NINDS, R01NS113516)から一部資金提供を受けた。

Materials

1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube Sorenson 16070
6-well plate TC Treated USA Scientific CC7682-7506
10 mL Pipette Tips OneTip USA Scientific 1110-3700
10 μL pipette tips OneTip USA Scientific 1110-3700
20-200 μL Beveled tips OneTip USA Scientific 1111-1210
50 mL Polypropylene Conical Tube Falcon 352070
96-Well Flipper Microtube Racks ThermoFisher Scientific 8770-11
96-well plate TC Treated  USA Scientific CC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Treated Dish USA Scientific CC7682-3394
1250 μL Tips OneTip USA Scientific 1112-1720
Centrifuge 5910 Ri – Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5943000131
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9% Sigma-Aldrich 276855-100ML
DMEM, high glucose ThermoFisher Scientific 11965092
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14190144
EHop 016 Bio-Techne Tocris 6248 Dissolve in DMSO; store at -70 °C
EnduRen Live Cell Substrate Promega E6481 Store aliquots at -70 °C
Eppendorf 2-20 μL pipette Eppendorf 3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipette Eppendorf 3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipette Eppendorf 3123000020
Eppendorf Research plus 12-channel Eppendorf 3125000028
Eppendorf Research plus 200 μL pipette Eppendorf  3123000055
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions ThermoFisher Scientific 10437028
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 381
Hand tally counter Sigma-Aldrich HS6594
HEK 293T Cells ATCC CRL-3216
Hemacytometer – Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber LW Scientific CTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE Buffer ThermoFisher Scientific 8019005
Microscope Zeiss Axiovert 25 CFL
Mini centrifuge Benchmark Scientific C1012
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge Tubes Boekel Scientific 120008
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) Polysciences 24765-100MG
Pipet-Aid XP USA Scientific 4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P6407-5MG
Rhosin hydrochloride Bio-Techne Tocris 5003 Dissolve in DMSO; store at -70 °C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300054
Varioskan LUX multimode microplate reader ThermoFisher Scientific VL0000D0
Vortex ThermoFisher Scientific 2215365 level 8
VWR Vacuum Aspiration System VWR 75870-734
ZCL 278 Bio-Techne Tocris 4794 Dissolve in DMSO; store at -70 °C

参考文献

  1. Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828 (2021).
  2. Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport. Front Cell Dev Biol. 10, 988014 (2022).
  3. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nat Commun. 10 (1), 1287 (2019).
  4. Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology. Cell. 187 (2), 257-270 (2024).
  5. Paillusson, S., et al. There’s something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases. Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).
  6. Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes. Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).
  7. Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained. Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).
  8. Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases. Front Cell Dev Biol. 7, 172 (2019).
  9. Rieusset, J. The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update. Cell Death Dis. 9 (3), 388 (2018).
  10. Bouguerra, M. D., Lalli, E. ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).
  11. Tepikin, A. V. Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective. Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).
  12. Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. A computational model of motor neuron degeneration. Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).
  13. Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches. Int J Mol Sci. 21 (21), 8157 (2020).
  14. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
  15. Valm, A. M., et al. Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome. Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).
  16. Csordás, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
  17. Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  18. Kakimoto, Y., et al. Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system. Sci Rep. 8 (1), 6175 (2018).
  19. Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions. Mol Biol Cell. 25 (22), (2014).
  20. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
  21. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).
  22. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).
  23. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  24. Lim, Y., Cho, I. -. T., Rennke, H. G., Cho, G. β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts. Sci Rep. 11 (1), 21477 (2021).
  25. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
  26. Cho, I. -. T., et al. Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts. J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).
  27. Lim, Y., Cho, I. -. T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts. Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).
  28. Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function. Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).

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記事を引用
Chen, C., Rafael, K. A., Cho, G., Lim, Y. Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells. J. Vis. Exp. (212), e66862, doi:10.3791/66862 (2024).

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