私たちは、生細胞の小胞体-ミトコンドリア接触をモニターするためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイを確立しました。このアッセイを用いて、化学処理の条件下で、HEK293T細胞内のこれらのオルガネラ間カップリングのレベルを定量的に測定するプロトコールを記載します。
小胞体(ER)-ミトコンドリア接触部位は、Ca2+ および脂質恒常性の調節、ミトコンドリアダイナミクス、オートファゴソームおよびミトファゴソームの生合成、アポトーシスなど、細胞の健康および恒常性において重要な役割を果たします。正常なERとミトコンドリアの結合を維持できないことは、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、遺伝性痙性対麻痺など、多くの神経変性疾患に関与しています。ERとミトコンドリアの接触の調節不全がどのように細胞死につながるか、そしてこれらの接触を正常なレベルに修復することで神経変性疾患を改善できるかどうかを調査することは非常に重要です。したがって、これらの接触のレベルを測定する改良されたアッセイは、これらの疾患の病原性メカニズムを明らかにするのに役立つ可能性があります。最終的には、シンプルで信頼性の高いアッセイを確立することで、新しい治療戦略の開発が容易になります。ここでは、生細胞内のER-ミトコンドリア接触レベルを定量的に測定するためのスプリットルシフェラーゼアッセイについて説明します。このアッセイは、これらの接触の病態生理学的役割を研究するためだけでなく、ハイスループットスクリーニングにおけるそれらのモジュレーターの同定にも使用できます。
小胞体とミトコンドリアとの間の相互作用は、細胞の恒常性と生存に不可欠です1,2,3,4。以前の証拠は、ER-ミトコンドリア接触部位におけるあらゆる種類の混乱または調節不全が、いくつかの神経変性疾患、代謝性疾患、および心血管疾患、ならびに癌5,6,7,8,9,10に寄与する可能性があることを示しています。例えば、ミトコンドリアへのCa2+の取り込みが異常に増加すると、アルツハイマー病の一部のモデルでよく見られるミトコンドリア透過性遷移孔が開き、細胞死につながる可能性があります5,11。同様に、ERとミトコンドリアの接触の減少は、筋萎縮性側索硬化症のモデルに見られるように、ATP産生の減少とCa2+摂取の障害をもたらす可能性があります5,11,12。ERとミトコンドリアの接触の領域でより多くの研究が行われるにつれて、これらの接触に影響を与える可能性のある追加の疾患関連タンパク質と遺伝子が発見されています。ERとミトコンドリアの接触部位の役割を示す現在の知識と証拠にもかかわらず、これらの接触がどのように細胞機能の喪失、そして最終的には細胞死につながるかを解明するには、まだ多くの研究が必要です。
2つの膜の近接性、構造形態、および2つの細胞小器官接触部位3,4,13間の距離を評価するために、さまざまな方法が開発されてきました。ER-ミトコンドリア結合をモニターするアプローチには、蛍光マーカーベースのイメージング14,15、FRETレポーターベースのイメージング16、および分外蛍光プローブベースのイメージング17,18が含まれ、落射蛍光および共焦点顕微鏡を使用する。超解像顕微鏡法および原子分解能顕微鏡法も、オルガネラ間接触を正確に視覚化するための強力なツールであるが、接触部位分析におけるそれらの利用は、高度に専用の顕微鏡と技術的専門知識を必要とするため、依然として限られている19。さらに、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)、および電子線トモグラフィー(ET)やクライオ電子顕微鏡などの他のEM技術は、接触部位の高解像度の超微細構造イメージングを提供するため、一般的に使用されていますが、これは他の実験的アプローチでは探索が不可能なことが多い20,21,22。.しかし、これらのEMベースの方法は、非常にロースループットの手法であり、化学固定手順の影響も受ける可能性があります。最近では、近接ラベリングベースの方法を使用して、接触部位を検出したり、新しい接触部位タンパク質を同定したりしています。例えば、近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、オルガネラの近接性を定量するために使用されてきた23,24一方、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX)アッセイの改訂版は、新しい接触部位タンパク質の同定に利用されてきた25,26。上記のすべての方法には、オルガネラ間の接触を検出する上で長所と固有の制限があることを認識することが重要です。したがって、オルガネラ接触部位の徹底的な解釈を得るためには、異なる技術の組み合わせが必要です。
以前に、ERミトコンドリア膜接触のレベルを監視するために、split-Renillaルシフェラーゼ8再構成アッセイ(split-Rlucアッセイ)を確立しました(図1A)24,26,27。簡単に言うと、Renillaルシフェラーゼの各分割された半分は、ERまたはミトコンドリアの標的配列と結合されています。一緒にトランスフェクトすると、酵素の各分割された半分はERまたはミトコンドリア膜のいずれかで発現します。ERとミトコンドリアが互いに近接して配置されると、分割された半分が一緒になり、ルシフェラーゼ活性を持つ酵素全体が再構成されます。split-Rluc コンストラクトでは、初期テンプレートに pBAD/Myc-His27 の Renilla luciferase 8 (Rluc8) を使用しました。分裂部位(アミノ酸91と92の間)は、以前の報告27に基づいて決定された。Rluc8のN末端半分については、PCR27により、R luc8のアミノ酸1-91のDNA配列をFLAGタグの3’末端とマウスAKAP1ミトコンドリア標的配列のpcDNA3.1 TOPOベクターに融合させた。小胞体を標的とするC末端の半分については、アミノ酸92-311をコードするDNA配列をmycタグの5’末端と酵母UBC6 ER局在配列に融合させた。ここでは、Renillaルシフェラーゼの分割半分が同じプロモーターの下で単一ベクター(pCAG)で発現し、その後、Thosea asignaウイルス由来の自己切断ペプチド2A配列であるT2Aが2つの分割半分の間に挿入されるときに2つのフラグメントに切断されるように、split-R lucプラスミドコンストラクトをアップグレードしました(図1B)。プラスミドDNAマップおよび配列は、補足ファイル1および補足図S1に記載されています。このシステムを用いて、3つの化学物質(アクチン重合に関与するGTPaseを阻害する物質)がER-ミトコンドリアの接触に及ぼす影響を測定しました。このsplit-Rlucアッセイは、細胞小器官間接触モジュレーター24のハイスループットスクリーニングのためのシンプルでありながら堅牢なアッセイシステムです。
私たちは、ER-ミトコンドリアカップリングのレベルを定量するために、split-Renillaルシフェラーゼ8再構成アッセイ(split-Rlucアッセイ)を使用しました。本研究では、ルシフェラーゼの各分割半分が同量の発現を確保するために、各split-Rluc成分(MitoRlucNおよびRlucCER)およびThosea asignaウイルス由来の自己切断ペプチド2…
The authors have nothing to disclose.
著者らは、原稿の批判的なレビューについて、Jeffrey Golden博士(Cedars-Sinai Medical Center)に感謝しています。この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(NINDS, R01NS113516)から一部資金提供を受けた。
1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube | Sorenson | 16070 | |
6-well plate TC Treated | USA Scientific | CC7682-7506 | |
10 mL Pipette Tips OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
10 μL pipette tips OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
20-200 μL Beveled tips OneTip | USA Scientific | 1111-1210 | |
50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | |
96-Well Flipper Microtube Racks | ThermoFisher Scientific | 8770-11 | |
96-well plate TC Treated | USA Scientific | CC7682-7596 | |
100 mm x 20 mm TC Treated Dish | USA Scientific | CC7682-3394 | |
1250 μL Tips OneTip | USA Scientific | 1112-1720 | |
Centrifuge 5910 Ri – Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5943000131 | |
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9% | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
EHop 016 | Bio-Techne Tocris | 6248 | Dissolve in DMSO; store at -70 °C |
EnduRen Live Cell Substrate | Promega | E6481 | Store aliquots at -70 °C |
Eppendorf 2-20 μL pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipette | Eppendorf | 3123000020 | |
Eppendorf Research plus 12-channel | Eppendorf | 3125000028 | |
Eppendorf Research plus 200 μL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless Steel | ThermoFisher Scientific | 381 | |
Hand tally counter | Sigma-Aldrich | HS6594 | |
HEK 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | |
Hemacytometer – Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber | LW Scientific | CTL-HEMM-GLDR | |
Invitrogen TE Buffer | ThermoFisher Scientific | 8019005 | |
Microscope | Zeiss | Axiovert 25 CFL | |
Mini centrifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge Tubes | Boekel Scientific | 120008 | |
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences | 24765-100MG | |
Pipet-Aid XP | USA Scientific | 4440-0101 | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
Rhosin hydrochloride | Bio-Techne Tocris | 5003 | Dissolve in DMSO; store at -70 °C |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
Varioskan LUX multimode microplate reader | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | |
Vortex | ThermoFisher Scientific | 2215365 | level 8 |
VWR Vacuum Aspiration System | VWR | 75870-734 | |
ZCL 278 | Bio-Techne Tocris | 4794 | Dissolve in DMSO; store at -70 °C |