Hemos establecido un ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. Con este ensayo, describimos un protocolo para medir cuantitativamente el nivel de estos acoplamientos interorgánulos en HEK293T células, bajo la condición de tratamiento químico.
Los sitios de contacto entre el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias desempeñan un papel fundamental en la salud y la homeostasis celular, como la regulación del Ca2+ y la homeostasis lipídica, la dinámica mitocondrial, la biogénesis de autofagosomas y mitofagosomas y la apoptosis. La falta de mantenimiento del acoplamiento normal entre el RE y la mitocondria está implicada en muchas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la paraplejia espástica hereditaria. Es de considerable importancia explorar cómo la desregulación de los contactos ER-mitocondriales podría conducir a la muerte celular y si la reparación de estos contactos al nivel normal podría mejorar las condiciones neurodegenerativas. Por lo tanto, los ensayos mejorados que miden el nivel de estos contactos podrían ayudar a esclarecer los mecanismos patogénicos de estas enfermedades. En última instancia, el establecimiento de ensayos sencillos y fiables facilitará el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Aquí describimos un ensayo de luciferasa dividida para medir cuantitativamente el nivel de contactos ER-mitocondrias en células vivas. Este ensayo se puede utilizar para estudiar el papel fisiopatológico de estos contactos, así como para identificar sus moduladores en el cribado de alto rendimiento.
Las interacciones entre el RE y las mitocondrias son vitales para la homeostasis celular y la supervivencia 1,2,3,4. La evidencia previa indica que cualquier tipo de interrupción o desregulación en los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias puede contribuir a varias enfermedades neurodegenerativas, metabólicas y cardiovasculares, así como al cáncer 5,6,7,8,9,10. Por ejemplo, un aumento anormal de la absorción de Ca2+ en las mitocondrias puede conducir a la muerte celular al abrir los poros de transición de permeabilidad de las mitocondrias, que se observan comúnmente en algunos modelos de enfermedad de Alzheimer 5,11. Del mismo modo, la reducción de los contactos entre el RE y las mitocondrias puede dar lugar a una disminución de la producción de ATP y a un deterioro de la ingesta de Ca2+, como se observa en modelos de esclerosis lateral amiotrófica 5,11,12. A medida que se realizan más estudios en el ámbito de los contactos entre el RE y las mitocondrias, se descubren proteínas y genes adicionales relacionados con la enfermedad que podrían afectar a estos contactos. A pesar de los conocimientos y las pruebas actuales que muestran el papel de los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias, aún se necesita mucho trabajo para dilucidar cómo estos contactos podrían conducir a la pérdida de la función celular y, en última instancia, a la muerte celular.
Se han desarrollado varios métodos para evaluar la proximidad de las dos membranas, la morfología estructural y la distancia entre los dos sitios de contacto de los orgánulos 3,4,13. Los enfoques para monitorear el acoplamiento ER-mitocondrias incluyen imágenes basadas en marcadores de fluorescencia 14,15, imágenes basadas en reporteros FRET16 e imágenes basadas en sondas de fluorescencia dividida17,18, que utilizan epifluorescencia y microscopía confocal. La microscopía de superresolución y la microscopía de resolución atómica también son herramientas poderosas para visualizar con precisión los contactos entre orgánulos, aunque su utilización en el análisis de sitios de contacto es todavía limitada, ya que requieren microscopios altamente dedicados y experiencia técnica19. Además, la microscopía electrónica de transmisión (TEM), la microscopía electrónica de barrido (SEM) y otras técnicas de EM como la tomografía electrónica (ET) y la criomicroscopía electrónica, se utilizan comúnmente, ya que proporcionan imágenes ultraestructurales de alta resolución de los sitios de contacto, que a menudo son imposibles de explorar utilizando otros enfoques experimentales 20,21,22. Sin embargo, estos métodos basados en EM son una técnica de muy bajo rendimiento que también puede verse afectada por los procedimientos de fijación química. Más recientemente, se han utilizado métodos basados en el marcaje de proximidad para detectar sitios de contacto, así como para identificar nuevas proteínas en el sitio de contacto. Por ejemplo, se ha utilizado el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) para cuantificar las proximidades de los orgánulos23,24, mientras que una versión revisada del ensayo de ascorbato peroxidasa (APEX) se ha utilizado para identificar nuevas proteínas en el sitio de contacto25,26. Es importante reconocer que todos estos métodos descritos anteriormente tienen fortalezas y limitaciones intrínsecas en la detección de los contactos entre los orgánulos. Por lo tanto, se requiere el emparejamiento de diferentes técnicas para obtener una interpretación completa de los sitios de contacto de los orgánulos.
Previamente hemos establecido el ensayo de reensamblaje de Renilla luciferasa 8 dividido (ensayo Split-Rluc) para monitorizar el nivel de contactos entre el RE y las mitocondrias en la membrana (Figura 1A)24,26,27. En resumen, cada mitad dividida de Renilla luciferasa se conjuga con una secuencia dirigida a RE o mitocondrias. Cuando se transfectan juntas, cada mitad dividida de la enzima se expresa en el RE o en la membrana mitocondrial. Cuando el RE y las mitocondrias se colocan muy cerca uno del otro, las mitades divididas se unen y reconstituyen toda la enzima con actividad luciferasa. Para la construcción split-Rluc, utilizamos Renilla luciferasa 8 (Rluc8) en pBAD/Myc-His27 para la plantilla inicial. El sitio de división (entre aminoácidos 91 y 92) se determinó con base en reportes previos27. Para la mitad N-terminal de la Rluc8, las secuencias de ADN de los aminoácidos 1-91 de la Rluc8 se fusionaron con el extremo 3′ de la etiqueta FLAG y la secuencia de diana mitocondrial AKAP1 del ratón en el vector TOPO pcDNA3.1 mediante PCR27. Para la mitad C-terminal dirigida al RE, las secuencias de ADN que codifican los aminoácidos 92-311 se fusionaron con el extremo 5′ de la etiqueta myc y la secuencia de localización del ER UBC6 de la levadura. Aquí, hemos mejorado la construcción del plásmido Rluc dividido de modo que las mitades divididas de la luciferasa Renilla se expresan en un solo vector (pCAG) bajo el mismo promotor y posteriormente se dividen en dos fragmentos a medida que T2A, una secuencia de péptido 2A autoescindido del virus Thosea asigna, se inserta entre las dos mitades divididas (Figura 1B). El mapa y las secuencias de ADN plasmídico se proporcionan en el Archivo Suplementario 1 y en la Figura Suplementaria S1. Utilizando este sistema, hemos medido los efectos de tres sustancias químicas (inhibidoras de las GTPasas implicadas en la polimerización de actina) en los contactos ER-mitocondrias. Este ensayo Split-Rluc es un sistema de ensayo simple pero robusto para el cribado de alto rendimiento para moduladores de contacto entre orgánulos24.
Hemos utilizado un ensayo de reensamblaje de Renilla luciferasa 8 dividido (ensayo Rluc dividido) para cuantificar el nivel de acoplamientos RE-mitocondrias. En este estudio, hemos modificado el constructo 24 original de split-Rlucgenerando un único vector, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, que codifica cada componente split-Rluc (MitoRlucN y Rluc<sup…
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen al Dr. Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado en parte por el Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS, R01NS113516).
1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube | Sorenson | 16070 | |
6-well plate TC Treated | USA Scientific | CC7682-7506 | |
10 mL Pipette Tips OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
10 μL pipette tips OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
20-200 μL Beveled tips OneTip | USA Scientific | 1111-1210 | |
50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | |
96-Well Flipper Microtube Racks | ThermoFisher Scientific | 8770-11 | |
96-well plate TC Treated | USA Scientific | CC7682-7596 | |
100 mm x 20 mm TC Treated Dish | USA Scientific | CC7682-3394 | |
1250 μL Tips OneTip | USA Scientific | 1112-1720 | |
Centrifuge 5910 Ri – Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5943000131 | |
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9% | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
EHop 016 | Bio-Techne Tocris | 6248 | Dissolve in DMSO; store at -70 °C |
EnduRen Live Cell Substrate | Promega | E6481 | Store aliquots at -70 °C |
Eppendorf 2-20 μL pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipette | Eppendorf | 3123000020 | |
Eppendorf Research plus 12-channel | Eppendorf | 3125000028 | |
Eppendorf Research plus 200 μL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless Steel | ThermoFisher Scientific | 381 | |
Hand tally counter | Sigma-Aldrich | HS6594 | |
HEK 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | |
Hemacytometer – Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber | LW Scientific | CTL-HEMM-GLDR | |
Invitrogen TE Buffer | ThermoFisher Scientific | 8019005 | |
Microscope | Zeiss | Axiovert 25 CFL | |
Mini centrifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge Tubes | Boekel Scientific | 120008 | |
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences | 24765-100MG | |
Pipet-Aid XP | USA Scientific | 4440-0101 | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
Rhosin hydrochloride | Bio-Techne Tocris | 5003 | Dissolve in DMSO; store at -70 °C |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
Varioskan LUX multimode microplate reader | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | |
Vortex | ThermoFisher Scientific | 2215365 | level 8 |
VWR Vacuum Aspiration System | VWR | 75870-734 | |
ZCL 278 | Bio-Techne Tocris | 4794 | Dissolve in DMSO; store at -70 °C |