Summary

Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas

Published: October 11, 2024
doi:

Summary

Hemos establecido un ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. Con este ensayo, describimos un protocolo para medir cuantitativamente el nivel de estos acoplamientos interorgánulos en HEK293T células, bajo la condición de tratamiento químico.

Abstract

Los sitios de contacto entre el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias desempeñan un papel fundamental en la salud y la homeostasis celular, como la regulación del Ca2+ y la homeostasis lipídica, la dinámica mitocondrial, la biogénesis de autofagosomas y mitofagosomas y la apoptosis. La falta de mantenimiento del acoplamiento normal entre el RE y la mitocondria está implicada en muchas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la paraplejia espástica hereditaria. Es de considerable importancia explorar cómo la desregulación de los contactos ER-mitocondriales podría conducir a la muerte celular y si la reparación de estos contactos al nivel normal podría mejorar las condiciones neurodegenerativas. Por lo tanto, los ensayos mejorados que miden el nivel de estos contactos podrían ayudar a esclarecer los mecanismos patogénicos de estas enfermedades. En última instancia, el establecimiento de ensayos sencillos y fiables facilitará el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Aquí describimos un ensayo de luciferasa dividida para medir cuantitativamente el nivel de contactos ER-mitocondrias en células vivas. Este ensayo se puede utilizar para estudiar el papel fisiopatológico de estos contactos, así como para identificar sus moduladores en el cribado de alto rendimiento.

Introduction

Las interacciones entre el RE y las mitocondrias son vitales para la homeostasis celular y la supervivencia 1,2,3,4. La evidencia previa indica que cualquier tipo de interrupción o desregulación en los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias puede contribuir a varias enfermedades neurodegenerativas, metabólicas y cardiovasculares, así como al cáncer 5,6,7,8,9,10. Por ejemplo, un aumento anormal de la absorción de Ca2+ en las mitocondrias puede conducir a la muerte celular al abrir los poros de transición de permeabilidad de las mitocondrias, que se observan comúnmente en algunos modelos de enfermedad de Alzheimer 5,11. Del mismo modo, la reducción de los contactos entre el RE y las mitocondrias puede dar lugar a una disminución de la producción de ATP y a un deterioro de la ingesta de Ca2+, como se observa en modelos de esclerosis lateral amiotrófica 5,11,12. A medida que se realizan más estudios en el ámbito de los contactos entre el RE y las mitocondrias, se descubren proteínas y genes adicionales relacionados con la enfermedad que podrían afectar a estos contactos. A pesar de los conocimientos y las pruebas actuales que muestran el papel de los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias, aún se necesita mucho trabajo para dilucidar cómo estos contactos podrían conducir a la pérdida de la función celular y, en última instancia, a la muerte celular.

Se han desarrollado varios métodos para evaluar la proximidad de las dos membranas, la morfología estructural y la distancia entre los dos sitios de contacto de los orgánulos 3,4,13. Los enfoques para monitorear el acoplamiento ER-mitocondrias incluyen imágenes basadas en marcadores de fluorescencia 14,15, imágenes basadas en reporteros FRET16 e imágenes basadas en sondas de fluorescencia dividida17,18, que utilizan epifluorescencia y microscopía confocal. La microscopía de superresolución y la microscopía de resolución atómica también son herramientas poderosas para visualizar con precisión los contactos entre orgánulos, aunque su utilización en el análisis de sitios de contacto es todavía limitada, ya que requieren microscopios altamente dedicados y experiencia técnica19. Además, la microscopía electrónica de transmisión (TEM), la microscopía electrónica de barrido (SEM) y otras técnicas de EM como la tomografía electrónica (ET) y la criomicroscopía electrónica, se utilizan comúnmente, ya que proporcionan imágenes ultraestructurales de alta resolución de los sitios de contacto, que a menudo son imposibles de explorar utilizando otros enfoques experimentales 20,21,22. Sin embargo, estos métodos basados en EM son una técnica de muy bajo rendimiento que también puede verse afectada por los procedimientos de fijación química. Más recientemente, se han utilizado métodos basados en el marcaje de proximidad para detectar sitios de contacto, así como para identificar nuevas proteínas en el sitio de contacto. Por ejemplo, se ha utilizado el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) para cuantificar las proximidades de los orgánulos23,24, mientras que una versión revisada del ensayo de ascorbato peroxidasa (APEX) se ha utilizado para identificar nuevas proteínas en el sitio de contacto25,26. Es importante reconocer que todos estos métodos descritos anteriormente tienen fortalezas y limitaciones intrínsecas en la detección de los contactos entre los orgánulos. Por lo tanto, se requiere el emparejamiento de diferentes técnicas para obtener una interpretación completa de los sitios de contacto de los orgánulos.

Previamente hemos establecido el ensayo de reensamblaje de Renilla luciferasa 8 dividido (ensayo Split-Rluc) para monitorizar el nivel de contactos entre el RE y las mitocondrias en la membrana (Figura 1A)24,26,27. En resumen, cada mitad dividida de Renilla luciferasa se conjuga con una secuencia dirigida a RE o mitocondrias. Cuando se transfectan juntas, cada mitad dividida de la enzima se expresa en el RE o en la membrana mitocondrial. Cuando el RE y las mitocondrias se colocan muy cerca uno del otro, las mitades divididas se unen y reconstituyen toda la enzima con actividad luciferasa. Para la construcción split-Rluc, utilizamos Renilla luciferasa 8 (Rluc8) en pBAD/Myc-His27 para la plantilla inicial. El sitio de división (entre aminoácidos 91 y 92) se determinó con base en reportes previos27. Para la mitad N-terminal de la Rluc8, las secuencias de ADN de los aminoácidos 1-91 de la Rluc8 se fusionaron con el extremo 3′ de la etiqueta FLAG y la secuencia de diana mitocondrial AKAP1 del ratón en el vector TOPO pcDNA3.1 mediante PCR27. Para la mitad C-terminal dirigida al RE, las secuencias de ADN que codifican los aminoácidos 92-311 se fusionaron con el extremo 5′ de la etiqueta myc y la secuencia de localización del ER UBC6 de la levadura. Aquí, hemos mejorado la construcción del plásmido Rluc dividido de modo que las mitades divididas de la luciferasa Renilla se expresan en un solo vector (pCAG) bajo el mismo promotor y posteriormente se dividen en dos fragmentos a medida que T2A, una secuencia de péptido 2A autoescindido del virus Thosea asigna, se inserta entre las dos mitades divididas (Figura 1B). El mapa y las secuencias de ADN plasmídico se proporcionan en el Archivo Suplementario 1 y en la Figura Suplementaria S1. Utilizando este sistema, hemos medido los efectos de tres sustancias químicas (inhibidoras de las GTPasas implicadas en la polimerización de actina) en los contactos ER-mitocondrias. Este ensayo Split-Rluc es un sistema de ensayo simple pero robusto para el cribado de alto rendimiento para moduladores de contacto entre orgánulos24.

Protocol

1. Mantenimiento de celdas y siembra (Día 1) Mantener HEK293T células en medios de cultivo celular que contengan el medio Eagle Modified de Dulbecco (DMEM) con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (en placas de cultivo de 100 mm) en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2. Antes de comenzar, verifique la confluencia de la placa observándola bajo el microscopio. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80-90% de confluenci…

Representative Results

Hemos utilizado el protocolo descrito anteriormente para medir el nivel de contactos ER-mitocondrias tras la adición de tres compuestos conocidos por inhibir GTPasas específicas. CDC42, Rho y RAC son GTPasas que promueven la polimerización de actina28 cuando se activan y son inhibidas por ZCL278, Rhosin y Ehop-016, respectivamente24. HEK293T células transfectadas con Split-Rluc se trataron con DMSO (control), ZCL278 (50 μM), R…

Discussion

Hemos utilizado un ensayo de reensamblaje de Renilla luciferasa 8 dividido (ensayo Rluc dividido) para cuantificar el nivel de acoplamientos RE-mitocondrias. En este estudio, hemos modificado el constructo 24 original de split-Rlucgenerando un único vector, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, que codifica cada componente split-Rluc (MitoRlucN y Rluc<sup…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen al Dr. Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado en parte por el Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS, R01NS113516).

Materials

1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube Sorenson 16070
6-well plate TC Treated USA Scientific CC7682-7506
10 mL Pipette Tips OneTip USA Scientific 1110-3700
10 μL pipette tips OneTip USA Scientific 1110-3700
20-200 μL Beveled tips OneTip USA Scientific 1111-1210
50 mL Polypropylene Conical Tube Falcon 352070
96-Well Flipper Microtube Racks ThermoFisher Scientific 8770-11
96-well plate TC Treated  USA Scientific CC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Treated Dish USA Scientific CC7682-3394
1250 μL Tips OneTip USA Scientific 1112-1720
Centrifuge 5910 Ri – Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5943000131
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9% Sigma-Aldrich 276855-100ML
DMEM, high glucose ThermoFisher Scientific 11965092
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14190144
EHop 016 Bio-Techne Tocris 6248 Dissolve in DMSO; store at -70 °C
EnduRen Live Cell Substrate Promega E6481 Store aliquots at -70 °C
Eppendorf 2-20 μL pipette Eppendorf 3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipette Eppendorf 3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipette Eppendorf 3123000020
Eppendorf Research plus 12-channel Eppendorf 3125000028
Eppendorf Research plus 200 μL pipette Eppendorf  3123000055
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions ThermoFisher Scientific 10437028
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 381
Hand tally counter Sigma-Aldrich HS6594
HEK 293T Cells ATCC CRL-3216
Hemacytometer – Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber LW Scientific CTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE Buffer ThermoFisher Scientific 8019005
Microscope Zeiss Axiovert 25 CFL
Mini centrifuge Benchmark Scientific C1012
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge Tubes Boekel Scientific 120008
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) Polysciences 24765-100MG
Pipet-Aid XP USA Scientific 4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P6407-5MG
Rhosin hydrochloride Bio-Techne Tocris 5003 Dissolve in DMSO; store at -70 °C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300054
Varioskan LUX multimode microplate reader ThermoFisher Scientific VL0000D0
Vortex ThermoFisher Scientific 2215365 level 8
VWR Vacuum Aspiration System VWR 75870-734
ZCL 278 Bio-Techne Tocris 4794 Dissolve in DMSO; store at -70 °C

Referencias

  1. Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828 (2021).
  2. Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport. Front Cell Dev Biol. 10, 988014 (2022).
  3. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nat Commun. 10 (1), 1287 (2019).
  4. Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology. Cell. 187 (2), 257-270 (2024).
  5. Paillusson, S., et al. There’s something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases. Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).
  6. Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes. Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).
  7. Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained. Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).
  8. Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases. Front Cell Dev Biol. 7, 172 (2019).
  9. Rieusset, J. The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update. Cell Death Dis. 9 (3), 388 (2018).
  10. Bouguerra, M. D., Lalli, E. ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).
  11. Tepikin, A. V. Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective. Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).
  12. Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. A computational model of motor neuron degeneration. Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).
  13. Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches. Int J Mol Sci. 21 (21), 8157 (2020).
  14. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
  15. Valm, A. M., et al. Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome. Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).
  16. Csordás, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
  17. Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  18. Kakimoto, Y., et al. Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system. Sci Rep. 8 (1), 6175 (2018).
  19. Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions. Mol Biol Cell. 25 (22), (2014).
  20. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
  21. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).
  22. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).
  23. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  24. Lim, Y., Cho, I. -. T., Rennke, H. G., Cho, G. β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts. Sci Rep. 11 (1), 21477 (2021).
  25. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
  26. Cho, I. -. T., et al. Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts. J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).
  27. Lim, Y., Cho, I. -. T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts. Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).
  28. Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function. Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).

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Chen, C., Rafael, K. A., Cho, G., Lim, Y. Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells. J. Vis. Exp. (212), e66862, doi:10.3791/66862 (2024).

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