Wir haben einen Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay etabliert, um die Kontakte zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen zu überwachen. Mit diesem Assay beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Messung des Ausmaßes dieser Interorganellenkopplungen in HEK293T Zellen unter den Bedingungen einer chemischen Behandlung.
Die Kontaktstellen des endoplasmatischen Retikulums (ER)-Mitochondrien spielen eine entscheidende Rolle für die Zellgesundheit und Homöostase, wie z. B. die Regulation der Ca2+ – und Lipidhomöostase, die mitochondriale Dynamik, die Biogenese von Autophagosomen und Mitophagosomen sowie die Apoptose. Das Versagen der Aufrechterhaltung einer normalen ER-mitochondrialen Kopplung ist an vielen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, amyotropher Lateralsklerose und hereditärer spastischer Querschnittslähmung beteiligt. Es ist von erheblicher Bedeutung zu untersuchen, wie die Dysregulation von ER-mitochondrialen Kontakten zum Zelltod führen könnte und ob die Reparatur dieser Kontakte auf das normale Niveau neurodegenerative Zustände verbessern könnte. Daher könnten verbesserte Assays, die das Niveau dieser Kontakte messen, dazu beitragen, die pathogenen Mechanismen dieser Krankheiten zu beleuchten. Letztendlich wird die Etablierung einfacher und zuverlässiger Assays die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien erleichtern. Hier beschreiben wir einen Split-Luciferase-Assay zur quantitativen Messung des Ausmaßes von ER-Mitochondrien-Kontakten in lebenden Zellen. Dieser Assay kann verwendet werden, um die pathophysiologische Rolle dieser Kontakte zu untersuchen und ihre Modulatoren im Hochdurchsatz-Screening zu identifizieren.
Die Wechselwirkungen zwischen dem ER und den Mitochondrien sind entscheidend für die zelluläre Homöostase und das Überleben 1,2,3,4. Frühere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass jede Art von Störung oder Dysregulation in den Kontaktstellen der ER-Mitochondrien zu verschiedenen neurodegenerativen, metabolischen und kardiovaskulären Erkrankungen sowie zu Krebs beitragenkann 5,6,7,8,9,10. Zum Beispiel kann eine abnormale Erhöhung der Ca2+-Aufnahme in die Mitochondrien zum Zelltod führen, indem sie die Übergangsporen der Mitochondrien-Permeabilität öffnet, was in einigen Modellen der Alzheimer-Krankheit häufig zu beobachten ist 5,11. In ähnlicher Weise können reduzierte ER-Mitochondrien-Kontakte zu einer Abnahme der ATP-Produktion und einer Beeinträchtigung der Ca2+-Aufnahme führen, wie in Modellen der amyotrophen Lateralsklerosebeobachtet 5,11,12. Da immer mehr Studien im Bereich der ER-Mitochondrien-Kontakte durchgeführt werden, werden weitere krankheitsbezogene Proteine und Gene entdeckt, die diese Kontakte beeinflussen könnten. Trotz des derzeitigen Wissens und der Beweise, die die Rolle der Kontaktstellen zwischen ER und Mitochondrien belegen, ist noch viel Arbeit erforderlich, um aufzuklären, wie diese Kontakte zum Verlust der Zellfunktion und letztendlich zum Zelltod führen könnten.
Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Nähe der beiden Membranen, die strukturelle Morphologie und den Abstand zwischen den beiden Organellenkontaktstellen zu bewerten 3,4,13. Die Ansätze zur Überwachung der ER-Mitochondrien-Kopplung umfassen die auf Fluoreszenzmarkern basierende Bildgebung14,15, die FRET-Reporter-basierte Bildgebung16 und die auf Split-Fluoreszenzsonden basierende Bildgebung17,18, die Epifluoreszenz und konfokale Mikroskopie verwenden. Die hochauflösende und atomare Auflösungsmikroskopie ist ebenfalls ein leistungsfähiges Werkzeug für die genaue Visualisierung von Kontakten zwischen Organellen, obwohl ihr Einsatz in der Kontaktstellenanalyse noch begrenzt ist, da sie hochspezialisierte Mikroskope und technisches Know-how erfordert19. Darüber hinaus werden die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), die Rasterelektronenmikroskopie (REM) und andere EM-Techniken wie Elektronentomographie (ET) und Kryo-Elektronenmikroskopie häufig eingesetzt, da sie eine hochauflösende ultrastrukturelle Abbildung der Kontaktstellen ermöglichen, die mit anderen experimentellen Ansätzen oft nicht zu erforschen sind 20,21,22. Bei diesen EM-basierten Methoden handelt es sich jedoch um eine Technik mit sehr geringem Durchsatz, die auch durch chemische Fixierungsverfahren beeinträchtigt werden kann. In jüngerer Zeit wurden auf Proximity-Labeling basierende Methoden verwendet, um Kontaktstellen zu detektieren und neue Proteine an Kontaktstellen zu identifizieren. Zum Beispiel wurde der Proximity-Ligation-Assay (PLA) verwendet, um die Organellennähe zu quantifizieren23,24, während eine überarbeitete Version des Ascorbatperoxidase-Assays (APEX) zur Identifizierung neuer Proteine an der Kontaktstelleverwendet wurde 25,26. Es ist wichtig zu erkennen, dass alle diese oben beschriebenen Methoden Stärken und intrinsische Grenzen bei der Erkennung der Kontakte zwischen den Organellen haben. Daher ist die Kombination verschiedener Techniken erforderlich, um eine gründliche Interpretation der Kontaktstellen der Organellen zu erhalten.
Zuvor haben wir den Split-Renilla-Luciferase 8-Reassemblierungsassay (split-R luc-Assay) etabliert, um den Grad der ER-Mitochondrien-Membrankontakte zu überwachen (Abbildung 1A)24,26,27. Kurz gesagt, jede gespaltene Hälfte der Renilla-Luciferase ist mit einer ER- oder Mitochondrien-Targeting-Sequenz konjugiert. Wenn sie zusammen transfiziert werden, wird jede gespaltene Hälfte des Enzyms entweder in der ER- oder in der Mitochondrienmembran exprimiert. Wenn das ER und die Mitochondrien in unmittelbarer Nähe zueinander positioniert sind, kommen die gespaltenen Hälften zusammen und rekonstituieren das gesamte Enzym mit Luciferase-Aktivität. Für das split-R luc-Konstrukthaben wir Renilla luciferase 8 (Rluc8) in pBAD/Myc-His27 als initiale Vorlage verwendet. Die Spaltstelle (zwischen den Aminosäuren 91 und 92) wurde auf der Grundlage früherer Berichtebestimmt 27. Für die N-terminale Hälfte des Rluc8 wurden DNA-Sequenzen für die Aminosäuren 1-91 des Rluc8 mit dem 3′-Ende des FLAG-Tags und die mitochondriale AKAP1-Targeting-Sequenz der Maus im pcDNA3.1 TOPO-Vektor mittels PCR27 fusioniert. Für die C-terminale Hälfte, die auf das ER abzielt, wurden DNA-Sequenzen, die für die Aminosäuren 92-311 kodieren, mit dem 5′-Ende des myc-Tags und der UBC6-ER-Lokalisationssequenz der Hefe fusioniert. Hier haben wir das Split-R-luc-Plasmid-Konstruktso verbessert, dass gespaltene Hälften der Renilla-Luziferase in einem einzigen Vektor (pCAG) unter demselben Promotor exprimiert und anschließend in zwei Fragmente gespalten werden, wenn T2A, eine selbstspaltende Peptid-2A-Sequenz aus dem Thosea asigna-Virus, zwischen den beiden gespaltenen Hälften eingefügt wird (Abbildung 1B). Die Plasmid-DNA-Karte und die Sequenzen sind in der ergänzenden Datei 1 und der ergänzenden Abbildung S1 enthalten. Mit diesem System haben wir die Auswirkungen von drei Chemikalien (die GTPasen hemmen, die an der Aktinpolymerisation beteiligt sind) auf ER-Mitochondrien-Kontakte gemessen. Dieser split-R luc-Assayist ein einfaches, aber robustes Assay-System für das Hochdurchsatz-Screening von Interorganellen-Kontaktmodulatoren24.
Wir haben einen Split-Renilla-Luciferase-8-Reassemblierungs-Assay (Split-R luc-Assay) verwendet, um den Grad der ER-Mitochondrien-Kopplungen zu quantifizieren. In dieser Studie haben wir das ursprüngliche split-Rluc-Konstrukt24 modifiziert, indem wir einen einzelnen Vektor, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, erzeugt haben, der für jede split-Rluc-Komponente (MitoRlucN und R</…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Dr. Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde teilweise vom National Institute of Neurological Disease and Stroke (NINDS, R01NS113516) finanziert.
1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube | Sorenson | 16070 | |
6-well plate TC Treated | USA Scientific | CC7682-7506 | |
10 mL Pipette Tips OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
10 μL pipette tips OneTip | USA Scientific | 1110-3700 | |
20-200 μL Beveled tips OneTip | USA Scientific | 1111-1210 | |
50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | |
96-Well Flipper Microtube Racks | ThermoFisher Scientific | 8770-11 | |
96-well plate TC Treated | USA Scientific | CC7682-7596 | |
100 mm x 20 mm TC Treated Dish | USA Scientific | CC7682-3394 | |
1250 μL Tips OneTip | USA Scientific | 1112-1720 | |
Centrifuge 5910 Ri – Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5943000131 | |
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9% | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
EHop 016 | Bio-Techne Tocris | 6248 | Dissolve in DMSO; store at -70 °C |
EnduRen Live Cell Substrate | Promega | E6481 | Store aliquots at -70 °C |
Eppendorf 2-20 μL pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipette | Eppendorf | 3123000020 | |
Eppendorf Research plus 12-channel | Eppendorf | 3125000028 | |
Eppendorf Research plus 200 μL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless Steel | ThermoFisher Scientific | 381 | |
Hand tally counter | Sigma-Aldrich | HS6594 | |
HEK 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | |
Hemacytometer – Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber | LW Scientific | CTL-HEMM-GLDR | |
Invitrogen TE Buffer | ThermoFisher Scientific | 8019005 | |
Microscope | Zeiss | Axiovert 25 CFL | |
Mini centrifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge Tubes | Boekel Scientific | 120008 | |
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences | 24765-100MG | |
Pipet-Aid XP | USA Scientific | 4440-0101 | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
Rhosin hydrochloride | Bio-Techne Tocris | 5003 | Dissolve in DMSO; store at -70 °C |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
Varioskan LUX multimode microplate reader | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | |
Vortex | ThermoFisher Scientific | 2215365 | level 8 |
VWR Vacuum Aspiration System | VWR | 75870-734 | |
ZCL 278 | Bio-Techne Tocris | 4794 | Dissolve in DMSO; store at -70 °C |