Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila
Summary
Este artículo toma como ejemplo la transgénesis mediada por la integrasa phiC31 en Drosophila y presenta un protocolo optimizado para la microinyección de embriones, un paso crucial para la creación de moscas transgénicas.
Abstract
La transgénesis en Drosophila es un enfoque esencial para estudiar la función de los genes a nivel de organismo. La microinyección de embriones es un paso crucial para la construcción de moscas transgénicas. La microinyección requiere algunos tipos de equipos, incluidos un microinyector, un micromanipulador, un microscopio invertido y un microscopio estereoscópico. Los plásmidos aislados con un kit de minipreparación de plásmidos están calificados para microinyección. Los embriones en la etapa pre-blastodermo o blastodermo sincitial, donde los núcleos comparten un citoplasma común, se someten a microinyección. Un filtro de células facilita el proceso de descorionación de los embriones. El momento óptimo para la decorionación y desecación de los embriones debe determinarse experimentalmente. Para aumentar la eficiencia de la microinyección de embriones, las agujas preparadas por un extractor deben ser biseladas por un molinillo de agujas. En el proceso de molienda de agujas, utilizamos una bomba de aire de pie con un manómetro para evitar el efecto capilar de la punta de la aguja. Inyectamos rutinariamente entre 120 y 140 embriones para cada plásmido y obtenemos al menos una línea transgénica para alrededor del 85% de los plásmidos. Este artículo toma como ejemplo la transgénesis mediada por la integrasa phiC31 en Drosophila y presenta un protocolo detallado para la microinyección de embriones para la transgénesis en Drosophila.
Introduction
La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es extremadamente susceptible a la manipulación genética y al análisis genético. Las moscas transgénicas de la fruta son ampliamente utilizadas en la investigación biológica. Desde que se desarrolló a principios de la década de 1980, la transgénesis mediada por transposones del elemento P ha sido indispensable para la investigación de Drosophila 1. En algunos escenarios, otros transposones, como piggyBac y Minos, también se han utilizado para la transgénesis en Drosophila 2. Los transgenes a través de transposones se insertan aleatoriamente en el genoma de Drosophila, y los niveles de expresión de los transgenes en diferentes loci genómicos pueden variar debido a los efectos de posición y, por lo tanto, no se pueden comparar2. Estos inconvenientes fueron superados por la transgénesis específica del sitio3 mediada por phiC31. El gen bacteriófago phiC31 codifica una integrasa que media la recombinación específica de la secuencia entre los sitios attB y attP en Drosophila3. Muchos sitios de acoplamiento attP han sido caracterizados y están disponibles en el Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.
El sistema de transgénesis phiC31 para Drosophila ha sido ampliamente utilizado por la comunidad de moscas. Entre los sitios de acoplamiento de attP, attP18 en el cromosoma X, attP40 en el segundo cromosoma y attP2 en el tercer cromosoma suelen ser los sitios preferidos para la integración de transgenes en cada cromosoma porque los transgenes en los tres sitios muestran altos niveles de expresión inducible mientras que tienen bajos niveles de expresión basal5. Recientemente, sin embargo, van der Graaf y sus colegas descubrieron que el sitio attP40, cerca del locus del gen Msp300, y los transgenes integrados en attP40 causan el agrupamiento nuclear del músculo larvario en Drosophila10. En otro estudio reciente, Duan y sus colegas encontraron que el cromosoma homocigoto attP40 interrumpe la organización glomerular normal de la clase de neuronas receptoras olfativas Or47b en Drosophila11. Estos hallazgos sugieren que se deben incluir controles rigurosos al diseñar experimentos e interpretar los datos.
Drosophila es un organismo modelo ideal para la interrogación in vivo de la función génica debido a su corto ciclo de vida, bajo costo y fácil mantenimiento. El cribado genético de todo el genoma se basa en la construcción de bibliotecas de transgénicos de todo el genoma en Drosophila 12,13,14,15. Previamente generamos 5551 construcciones UAS-cDNA/ORF basadas en el sistema binario GAL4/secuencia activadora ascendente (GAL4/UAS), que cubren el 83% de los genes de Drosophila conservados en humanos en la Colección de Oro del Centro de Recursos Genómicos de Drosophila (DGRC)16. Los plásmidos UAS-cDNA/ORF se pueden utilizar para la creación de una biblioteca transgénica de UAS-cDNA/ORF en Drosophila. La tecnología eficiente de microinyección de embriones puede acelerar la creación de bibliotecas de moscas transgénicas.
Para la microinyección de embriones, la punta de la aguja normalmente se rompe contra un cubreobjetos17. Por lo tanto, las agujas con frecuencia se obstruyen o causan fugas de grandes cantidades de citoplasma, y cuando surgen estos problemas, se deben emplear nuevas agujas. Aunque las agujas de biselado pueden mejorar la eficiencia de la microinyección, la solución de molienda ingresa a la punta biselada durante el proceso de molienda. La solución de molienda en la punta biselada no se evapora rápidamente de forma natural; Por lo tanto, las agujas no se pueden utilizar para la microinyección directamente después del biselado. Estos factores reducen la eficiencia de los procedimientos de microinyección de embriones. Aquí, utilizando como ejemplo la transgénesis específica mediada por phiC31 en Drosophila , presentamos un protocolo para la microinyección de embriones para la transgénesis en Drosophila. Para evitar que la solución de molienda ingrese a la aguja, utilizamos una bomba de aire para ejercer presión de aire dentro de la aguja, evitando así que la solución de molienda ingrese a la punta biselada. Las agujas biseladas están listas para la carga de muestras y la microinyección directamente después del biselado.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo se presenta un protocolo de microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila. Para la transgénesis específica del sitio mediada por phiC31, inyectamos entre 120 y 140 embriones para cada plásmido y obtuvimos al menos una línea transgénica para alrededor del 85% de los plásmidos (Tabla suplementaria 2). En nuestra experiencia, el ADN plasmídico aislado por un kit de minipreparación de plásmidos es suficiente para la transgénesis en Drosophila. Las…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación Científica para Talentos de Alto Nivel de la Universidad del Sur de China.
Materials
| 100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
| 3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
| Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
| Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
| Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
| Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
| Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
| Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
References
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