Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila
Summary
Questo articolo prende come esempio la transgenesi mediata dall’integrasi phiC31 in Drosophila e presenta un protocollo ottimizzato per la microiniezione di embrioni, un passaggio cruciale per la creazione di mosche transgeniche.
Abstract
La transgenesi in Drosophila è un approccio essenziale per studiare la funzione genica a livello dell’organismo. La microiniezione di embrioni è un passaggio cruciale per la costruzione di mosche transgeniche. La microiniezione richiede alcuni tipi di apparecchiature, tra cui un microiniettore, un micromanipolatore, un microscopio invertito e uno stereomicroscopio. I plasmidi isolati con un kit di miniprep plasmidico sono qualificati per la microiniezione. Gli embrioni allo stadio di pre-blastoderma o blastoderma sinciziale, in cui i nuclei condividono un citoplasma comune, vengono sottoposti a microiniezione. Un colino cellulare facilita il processo di dechorionizzazione degli embrioni. Il momento ottimale per la decorionazione e l’essiccazione degli embrioni deve essere determinato sperimentalmente. Per aumentare l’efficienza della microiniezione di embrioni, gli aghi preparati da un estrattore devono essere smussati da una smerigliatrice ad aghi. Nel processo di rettifica degli aghi, utilizziamo una pompa dell’aria a pedale con un manometro per evitare l’effetto capillare della punta dell’ago. Iniettiamo abitualmente 120-140 embrioni per ogni plasmide e otteniamo almeno una linea transgenica per circa l’85% dei plasmidi. Questo articolo prende come esempio la transgenesi mediata dall’integrasi phiC31 in Drosophila e presenta un protocollo dettagliato per la microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila.
Introduction
Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster è estremamente suscettibile di manipolazione genetica e analisi genetica. I moscerini della frutta transgenici sono ampiamente utilizzati nella ricerca biologica. Da quando è stata sviluppata nei primi anni ’80, la transgenesi mediata da trasposoni di elementi P è stata indispensabile per laricerca sulla Drosophila. In alcuni scenari, altri trasposoni, come piggyBac e Minos sono stati utilizzati per la transgenesi in Drosophila 2. I transgeni tramite trasposone vengono inseriti casualmente nel genoma di Drosophila e i livelli di espressione dei transgeni in diversi loci genomici possono variare a causa degli effetti di posizione e quindi non possono essere confrontati2. Questi inconvenienti sono stati superati dalla transgenesi sito-specifica 3 mediata da phiC31. Il gene del batteriofago phiC31 codifica per un’integrasi che media la ricombinazione sequenza-specifica tra i siti attB e attP in Drosophila3. Molti siti di attracco attP sono stati caratterizzati e sono disponibili nel Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.
Il sistema di transgenesi phiC31 per Drosophila è stato ampiamente utilizzato dalla comunità delle mosche. Tra i siti di aggancio di attP, attP18 sul cromosoma X, attP40 sul secondo cromosoma e attP2 sul terzo cromosoma sono solitamente i siti preferiti per l’integrazione del transgene su ciascun cromosoma perché i transgeni nei tre siti mostrano alti livelli di espressione inducibile pur avendo bassi livelli di espressione basale5. Recentemente, tuttavia, van der Graaf e colleghi hanno scoperto che il sito attP40, vicino al locus del gene Msp300, e i transgeni integrati in attP40 causano il raggruppamento nucleare del muscolo larvale in Drosophila10. In un altro studio recente, Duan e colleghi hanno scoperto che il cromosoma omozigote attP40 interrompe la normale organizzazione glomerulare della classe di neuroni del recettore olfattivo Or47b in Drosophila11. Questi risultati suggeriscono che dovrebbero essere inclusi controlli rigorosi nella progettazione degli esperimenti e nell’interpretazione dei dati.
La Drosophila è un organismo modello ideale per l’interrogazione in vivo della funzione genica grazie al suo breve ciclo di vita, al basso costo e alla facile manutenzione. Lo screening genetico dell’intero genoma si basa sulla costruzione di librerie transgeniche dell’intero genoma in Drosophila 12,13,14,15. In precedenza abbiamo generato 5551 costrutti UAS-cDNA/ORF basati sul sistema binario GAL4/upstream activating sequence (GAL4/UAS), che coprono l’83% dei geni di Drosophila conservati nell’uomo nella Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16. I plasmidi UAS-cDNA/ORF possono essere utilizzati per la creazione di una libreria transgenica UAS-cDNA/ORF in Drosophila. Un’efficiente tecnologia di microiniezione di embrioni può accelerare la creazione di librerie di mosche transgeniche.
Per la microiniezione di embrioni, la punta dell’ago è normalmente rotta contro un vetrino coprioggetti17. In tal modo, gli aghi spesso si intasano o causano la fuoriuscita di grandi quantità di citoplasma e, quando si verificano questi problemi, è necessario utilizzare nuovi aghi. Sebbene gli aghi smussati possano migliorare l’efficienza della microiniezione, la soluzione di macinazione entra nella punta smussata durante il processo di macinazione. La soluzione di macinazione nella punta smussata non evapora rapidamente in modo naturale; pertanto, gli aghi non possono essere utilizzati per la microiniezione direttamente dopo la smussatura. Questi fattori riducono l’efficienza delle procedure di microiniezione embrionale. Qui, utilizzando come esempio la transgenesi sito-specifica mediata da phiC31 in Drosophila , presentiamo un protocollo per la microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila. Per evitare che la soluzione di macinazione entri nell’ago, utilizziamo una pompa dell’aria per esercitare una pressione dell’aria all’interno dell’ago, impedendo così alla soluzione di macinazione di entrare nella punta smussata. Gli aghi smussati sono pronti per il caricamento del campione e la microiniezione subito dopo la smussatura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo un protocollo per la microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila. Per la transgenesi sito-specifica mediata da phiC31, abbiamo iniettato 120-140 embrioni per ciascun plasmide e ottenuto almeno una linea transgenica per circa l’85% dei plasmidi (Tabella supplementare 2). Nella nostra esperienza, il DNA plasmidico isolato da un kit di miniprep plasmidico è sufficiente per la transgenesi in Drosophila. Concentrazioni di DNA plasmidico comprese tra 20 ng/μ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto dal Fondo per la ricerca scientifica per talenti di alto livello, Università della Cina meridionale.
Materials
| 100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
| 3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
| Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
| Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
| Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
| Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
| Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
| Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
References
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