Microinjection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile
Summary
Cet article prend l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présente un protocole optimisé pour la micro-injection embryonnaire, une étape cruciale pour la création de mouches transgéniques.
Abstract
La transgenèse chez la drosophile est une approche essentielle pour étudier la fonction des gènes au niveau de l’organisme. La micro-injection d’embryons est une étape cruciale pour la construction des mouches transgéniques. La micro-injection nécessite certains types d’équipement, notamment un micro-injecteur, un micromanipulateur, un microscope inversé et un stéréomicroscope. Les plasmides isolés à l’aide d’un kit de miniprep plasmidique sont qualifiés pour la micro-injection. Les embryons au stade pré-blastoderme ou blastoderme syncytial, où les noyaux partagent un cytoplasme commun, sont soumis à une micro-injection. Une passoire cellulaire facilite le processus de déchâtionnement des embryons. Le moment optimal pour la déchorionisation et la dessiccation des embryons doit être déterminé expérimentalement. Pour augmenter l’efficacité de la micro-injection d’embryons, les aiguilles préparées par un extracteur doivent être biseautées par un broyeur d’aiguilles. Dans le processus de broyage des aiguilles, nous utilisons une pompe à air à pied avec un manomètre pour éviter l’effet capillaire de la pointe de l’aiguille. Nous injectons régulièrement 120 à 140 embryons pour chaque plasmide et obtenons au moins une lignée transgénique pour environ 85 % des plasmides. Cet article prend l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présente un protocole détaillé pour la micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile.
Introduction
La mouche des fruits Drosophila melanogaster est extrêmement sensible à la manipulation génétique et à l’analyse génétique. Les mouches des fruits transgéniques sont largement utilisées dans la recherche biologique. Depuis son développement au début des années 1980, la transgenèse médiée par le transposon de l’élément P est indispensable à la recherche sur la drosophile 1. Dans certains scénarios, d’autres transposons, tels que piggyBac et Minos, ont également été utilisés pour la transgenèse chez la drosophile 2. Les transgènes via transposon sont insérés au hasard dans le génome de la drosophile, et les niveaux d’expression des transgènes à différents loci génomiques peuvent varier en raison des effets de position et ne peuvent donc pas être comparés2. Ces inconvénients ont été surmontés par la transgénèse spécifique au sitemédiée par phiC31 3. Le gène phiC31 du bactériophage code pour une intégrase qui médie la recombinaison spécifique de la séquence entre les sites attB et attP chez la drosophile3. De nombreux sites d’amarrage attP ont été caractérisés et sont disponibles dans le Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.
Le système de transgenèse phiC31 pour la drosophile a été largement utilisé par la communauté des mouches. Parmi les sites d’amarrage attP, attP18 sur le chromosome X, attP40 sur le deuxième chromosome et attP2 sur le troisième chromosome sont généralement les sites privilégiés pour l’intégration des transgènes sur chaque chromosome, car les transgènes sur les trois sites présentent des niveaux élevés d’expression inductible tout en ayant de faibles niveaux d’expression basale5. Récemment, cependant, van der Graaf et ses collègues ont découvert que le site attP40, proche du locus du gène Msp300, et les transgènes intégrés à attP40 provoquent le regroupement nucléaire des muscles larvaires chez la drosophile10. Dans une autre étude récente, Duan et ses collègues ont découvert que le chromosome homozygote attP40 perturbe l’organisation glomérulaire normale de la classe de neurones récepteurs olfactifs Or47b chez la drosophile11. Ces résultats suggèrent que des contrôles rigoureux devraient être inclus lors de la conception des expériences et de l’interprétation des données.
La drosophile est un organisme modèle idéal pour l’interrogation in vivo de la fonction des gènes en raison de son cycle de vie court, de son faible coût et de sa facilité d’entretien. Le criblage génétique à l’échelle du génome repose sur la construction de banques transgéniques à l’échelle du génome chez la drosophile 12,13,14,15. Nous avons précédemment généré 5551 constructions UAS-ADNc/ORF basées sur le système binaire GAL4/séquence d’activation en amont (GAL4/UAS), couvrant 83% des gènes de la drosophile conservés chez l’homme dans la collection Gold16 du Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). Les plasmides UAS-ADNc/ORF peuvent être utilisés pour la création d’une banque transgénique UAS-ADNc/ORF chez la drosophile. Une technologie efficace de micro-injection d’embryons peut accélérer la création de banques de mouches transgéniques.
Pour la microinjection d’embryons, la pointe de l’aiguille est normalement cassée contre une lamelle17. Ainsi, les aiguilles se bouchent fréquemment ou provoquent des fuites de grandes quantités de cytoplasme, et lorsque ces problèmes surviennent, de nouvelles aiguilles doivent être utilisées. Bien que les aiguilles biseautées puissent améliorer l’efficacité de la microinjection, la solution de broyage pénètre dans la pointe biseautée pendant le processus de broyage. La solution de broyage dans la pointe biseautée ne s’évapore pas rapidement naturellement ; Par conséquent, les aiguilles ne peuvent pas être utilisées pour la micro-injection directement après le biseautage. Ces facteurs réduisent l’efficacité des procédures de micro-injection d’embryons. Ici, en utilisant la transgenèse spécifique du site médiée par phiC31 chez la drosophile comme exemple, nous présentons un protocole de micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile. Pour empêcher la solution de broyage de pénétrer dans l’aiguille, nous utilisons une pompe à air pour exercer une pression d’air à l’intérieur de l’aiguille, empêchant ainsi la solution de broyage de pénétrer dans la pointe biseautée. Les aiguilles biseautées sont prêtes pour le chargement de l’échantillon et la micro-injection directement après le biseautage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons un protocole de micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile. Pour la transgenèse spécifique du site médiée par phiC31, nous avons injecté 120 à 140 embryons pour chaque plasmide et obtenu au moins une lignée transgénique pour environ 85 % des plasmides (tableau supplémentaire 2). D’après notre expérience, l’ADN plasmidique isolé par un kit de mini-préparation plasmidique suffit pour la transgenèse chez la drosophile. Des c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux ont été soutenus par le Fonds de recherche scientifique pour les talents de haut niveau de l’Université de Chine du Sud.
Materials
| 100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
| 3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
| Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
| Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
| Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
| Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
| Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
| Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
References
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