Embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila
Summary
Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een geoptimaliseerd protocol voor micro-injectie van embryo’s, een cruciale stap voor het creëren van transgene vliegen.
Abstract
Transgenese bij Drosophila is een essentiële benadering voor het bestuderen van de genfunctie op organismeniveau. Embryo-micro-injectie is een cruciale stap voor de bouw van transgene vliegen. Micro-injectie vereist bepaalde soorten apparatuur, waaronder een micro-injector, een micromanipulator, een omgekeerde microscoop en een stereomicroscoop. Plasmiden geïsoleerd met een plasmide miniprep-kit komen in aanmerking voor micro-injectie. Embryo’s in het pre-blastoderm of syncytieel blastoderm stadium, waar kernen een gemeenschappelijk cytoplasma delen, worden onderworpen aan micro-injectie. Een celzeef vergemakkelijkt het proces van het dechorioneren van embryo’s. Het optimale tijdstip voor dechorionatie en uitdroging van embryo’s moet experimenteel worden bepaald. Om de efficiëntie van embryo-micro-injectie te verhogen, moeten naalden die door een trekker zijn voorbereid, worden afgeschuind door een naaldslijper. Bij het slijpen van naalden gebruiken we een voetluchtpomp met een manometer om het capillaire effect van de naaldpunt te voorkomen. We injecteren routinematig 120-140 embryo’s voor elk plasmide en verkrijgen ten minste één transgene lijn voor ongeveer 85% van de plasmiden. Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een gedetailleerd protocol voor embryo-micro-injectie voor transgenese in Drosophila.
Introduction
De fruitvlieg Drosophila melanogaster is uitermate vatbaar voor genetische manipulatie en genetische analyse. Transgene fruitvliegjes worden veel gebruikt in biologisch onderzoek. Sinds de ontwikkeling in het begin van de jaren 1980 is P-element transposon-gemedieerde transgenese onmisbaar geweest voorhet onderzoek naar Drosophila. In sommige scenario’s zijn ook andere transposons, zoals piggyBac en Minos, gebruikt voor transgenese in Drosophila 2. Transgenen via transposon worden willekeurig ingevoegd in het Drosophila-genoom en de expressieniveaus van transgenen op verschillende genomische loci kunnen variëren als gevolg van positie-effecten en kunnen daardoor niet worden vergeleken2. Deze nadelen werden ondervangen door de phiC31-gemedieerde plaatsspecifieke transgenese3. Het bacteriofaag phiC31-gen codeert voor een integrase dat sequentiespecifieke recombinatie tussen de attB- en attP-sites in Drosophila3 bemiddelt. Veel attP-dockingplaatsen zijn gekarakteriseerd en zijn beschikbaar in het Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.
Het phiC31-transgenesesysteem voor Drosophila wordt veel gebruikt door de vliegengemeenschap. Van de attP-dockingplaatsen zijn attP18 op het X-chromosoom, attP40 op het tweede chromosoom en attP2 op het derde chromosoom meestal de voorkeursplaatsen voor transgenintegratie op elk chromosoom, omdat transgenen op de drie plaatsen hoge niveaus van induceerbare expressie vertonen terwijl ze lage niveaus van basale expressie hebben5. Onlangs ontdekten Van der Graaf en collega’s echter dat de attP40-site, dicht bij de Msp300-genlocus, en transgenen die zijn geïntegreerd op attP40 larvale spiernucleaire clustering veroorzaken in Drosophila10. In een andere recente studie ontdekten Duan en collega’s dat het homozygote attP40-chromosoom de normale glomerulaire organisatie van de Or47b-olfactorische receptorneuronklasse in Drosophila11 verstoort. Deze bevindingen suggereren dat strenge controles moeten worden opgenomen bij het ontwerpen van experimenten en het interpreteren van gegevens.
Drosophila is een ideaal modelorganisme voor in vivo ondervraging van de genfunctie vanwege de korte levenscyclus, lage kosten en eenvoudig onderhoud. Genoombrede genetische screening is gebaseerd op de constructie van genoombrede transgene bibliotheken in Drosophila 12,13,14,15. We hebben eerder 5551 UAS-cDNA/ORF-constructen gegenereerd op basis van het binaire GAL4/upstream activerende sequentie (GAL4/UAS) systeem, dat 83% van de Drosophila-genen omvat die bij mensen worden bewaard in de Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16. De UAS-cDNA/ORF-plasmiden kunnen worden gebruikt voor het creëren van een transgene UAS-cDNA/ORF-bibliotheek in Drosophila. Efficiënte micro-injectietechnologie voor embryo’s kan de creatie van transgene vliegenbibliotheken versnellen.
Voor micro-injectie van embryo’s wordt de punt van de naald normaal gesproken gebroken tegen een dekglaasje17. Daarbij raken naalden vaak verstopt of veroorzaken ze lekkage van grote hoeveelheden cytoplasma, en wanneer deze problemen zich voordoen, moeten nieuwe naalden worden gebruikt. Hoewel afschuinnaalden de efficiëntie van micro-injectie kunnen verbeteren, komt de slijpoplossing tijdens het slijpproces in de afgeschuinde punt. De maaloplossing in de afgeschuinde punt verdampt niet snel op natuurlijke wijze; Daarom kunnen naalden niet direct na het afschuinen worden gebruikt voor micro-injectie. Deze factoren verminderen de efficiëntie van micro-injectieprocedures voor embryo’s. Hier presenteren we, met behulp van de phiC31-gemedieerde plaatsspecifieke transgenese in Drosophila als voorbeeld, een protocol voor embryo-micro-injectie voor transgenese in Drosophila. Om te voorkomen dat de slijpoplossing de naald binnendringt, gebruiken we een luchtpomp om luchtdruk uit te oefenen in de naald, waardoor wordt voorkomen dat de slijpoplossing de afgeschuinde punt binnendringt. Afgeschuinde naalden zijn direct na het afschuinen klaar voor het laden van monsters en micro-injectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een protocol voor embryo-micro-injectie voor transgenese in Drosophila. Voor phiC31-gemedieerde plaatsspecifieke transgenese injecteerden we 120-140 embryo’s voor elk plasmide en verkregen we ten minste één transgene lijn voor ongeveer 85% van de plasmiden (aanvullende tabel 2). Onze ervaring is dat plasmide-DNA geïsoleerd door een plasmide-miniprep-kit volstaat voor transgenese in Drosophila. Plasmide-DNA-concentraties variërend van 20 ng/μL tot 1683 ng/μL heb…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund door het Scientific Research Fund for High-Level Talents, University of South China.
Materials
| 100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
| 3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
| Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
| Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
| Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
| Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
| Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
| Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
References
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. Génétique. 166 (4), 1775-1782 (2004).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).
- Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange. Génétique. 173 (2), 769-777 (2006).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
- Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells. G3. 2 (9), 1095-1102 (2012).
- Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).
- Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300. PLoS One. 17 (12), e0278598 (2022).
- Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons. G3. 13 (4), 022 (2023).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Bellen, H. J., et al. The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities. Génétique. 188 (3), 731-743 (2011).
- Zirin, J., et al. Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Génétique. 214 (4), 755-767 (2020).
- Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).
- Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. Production of transgenic Drosophila. Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes. Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).
