Summary

Z-Scores pour l’évaluation de la réserve ovarienne chez les jeunes patientes subissant une préservation de la fertilité

Published: October 25, 2024
doi:

Summary

Le présent protocole décrit une méthode d’évaluation de la réserve ovarienne chez les patientes de moins de 25 ans qui nécessitent une préservation de la fertilité par cryoconservation du tissu ovarien. Cette méthode implique : (1) l’évaluation histologique de la réserve ovarienne dans les échantillons corticaux, (2) la comparaison avec un ensemble de données de référence, et (3) le calcul des scores Z.

Abstract

Les femmes naissent avec un pool non renouvelable de follicules ovariens, appelé réserve ovarienne. Cette réserve se compose de follicules primordiaux dans les ovaires et peut être affectée par de nombreux facteurs, tels que des troubles génétiques et endocriniens, des interventions médicales et des perturbateurs endocriniens. La préservation de la fertilité est recommandée lorsque des traitements gonadotoxiques sont nécessaires. Les options préférées des femmes sont la cryoconservation des ovocytes et des embryons. Cependant, chez les patientes très jeunes et sexuellement immatures, la cryoconservation du tissu ovarien est la seule option. Connaître la densité folliculaire des échantillons de tissus cryoconservés est essentiel dans le conseil en fertilité pour les jeunes patients. Ce protocole démontre l’utilisation des Z-scores pour la densité folliculaire corticale comme outil d’évaluation de la qualité du tissu ovarien chez les filles et les jeunes femmes âgées de 25 ans et moins qui subissent une préservation de la fertilité. La densité folliculaire dans les échantillons de patients est comparée aux étalons de référence normalisés selon l’âge, développés par Hassan et al. pour estimer les écarts possibles par rapport à l’étalon. La densité folliculaire est mesurée par quantification histologique. Pour cela, un petit morceau de tissu cortical ovarien (~2 mm x 2 mm x 2 mm) est fixé dans une solution de Bouin ou de formaldéhyde, noyé dans de la paraffine, sectionné à 4 μm d’épaisseur, coloré à l’hématoxyline et à l’éosine, et numérisé à l’aide d’un scanner de lames. Les stades folliculaires présents dans le cortex vont des follicules primordiaux aux follicules primaires. La zone corticale était à 1 mm de l’épithélium de surface sur les coupes histologiques. La densité folliculaire est calculée à l’aide d’une formule modifiée présentée par Schmidt et al., et le score Z est déterminé à l’aide de la moyenne de référence et de l’écart-type. Le score Z indique dans quelle mesure la valeur mesurée s’écarte de la moyenne de référence, déterminant la réserve ovarienne réduite (<-1,7 score Z). Avec cette méthode, les densités folliculaires peuvent être utilisées comme une mesure précieuse de la réserve ovarienne pour les jeunes patientes nécessitant une préservation de la fertilité.

Introduction

L’ovaire est un organe dynamique, actif sur le plan endocrinologique, composé d’un cortex externe et d’une moelle épinière interne. Les follicules sont répartis de manière hétérogène dans les ovaires, qui contiennent l’ovocyte gonadique entouré de cellules de la granulosa stromale1. Tous les follicules sont déjà formés au cours du développement fœtal, culminant vers 20 semaines d’âge gestationnel, suivi d’un déclin exponentiel. À la naissance, 1 à 2 millions de follicules primordiaux restent dans le cortex, et seulement quelques centaines de milliers de follicules survivent jusqu’à la puberté2. Le pool de follicules non en croissance, également appelé réserve ovarienne, influence la fertilité d’une femme, entre autres facteurs. La réserve ovarienne réside dans le cortex et se déplace dans la moelle à mesure que les follicules grandissent et mûrissent. Certains chercheurs reconnaissent que la réserve ovarienne est composée uniquement de follicules primordiaux, tandis que d’autres comprennent tous les follicules unilaminaires (c’est-à-dire primordiaux, intermédiaires et primaires)3,4,5,6. Au cours de la vie d’une femme, seuls 300 à 400 follicules mûrissent et survivent pour finalement subir l’ovulation. La ménopause commence lorsque le nombre de follicules tombe à environ un millier, ce qui se produit généralement vers 50 ans ou 7 ans. Il y a actuellement un débat en cours concernant la présence de cellules souches oogoniennes (CSO) dans les ovaires humains adultes qui peuvent former des ovocytes après une xénotransplantation. Certaines études suggèrent d’isoler des cellules qui expriment un profil génétique de cellules germinales primitives et se différencient en ovocytes 8,9, tandis que d’autres indiquent que les OSC présumés sont des cellules périvasculaires des vaisseaux sanguins 10,11,12.

L’insuffisance ovarienne prématurée (POI) se définit par l’arrêt du cycle menstruel avec une élévation du taux de FSH avant l’âge de 40 ans13. Les causes de l’IOP sont multifactorielles et peuvent survenir de manière idiopathique ; Cependant, il survient souvent à la suite de conditions médicales14. Par exemple, certaines maladies génétiques congénitales sont associées à la POI en raison d’une réserve ovarienne réduite dès la naissance, comme le syndrome de Turner15. Le POI peut également survenir en tant qu’effet secondaire des traitements gonadotoxiques, ce qui est particulièrement problématique chez les très jeunes patientes car il peut entraîner une incapacité à subir une puberté normale et altérer considérablement la réserve ovarienne. En fonction du risque de POI et de l’âge de la patiente, plusieurs options de préservation de la fertilité sont disponibles, telles que la cryoconservation d’ovocytes matures, la cryoconservation d’embryons après fécondation in vitro et la cryoconservation de tissus ovariens (OTC). Pour les patientes prépubères, l’OTC est la seule option réalisable en raison de leur immaturité sexuelle16,17. Aux États-Unis, la préservation de la fertilité par le biais d’un médicament en vente libre a récemment été considérée comme une routine clinique acceptable18. Cependant, l’OTC est encore considéré comme expérimental dans de nombreux pays européens, et une approbation éthique est requise, en particulier pour l’auto-transplantation19,20. Par conséquent, les critères d’inclusion des protocoles en vente libre doivent être soigneusement examinés et une analyse risques-avantages doit être effectuée pour chaque patient. Tous les enfants recevant des thérapies gonadotoxiques ne sont pas éligibles à la préservation de la fertilité. En Suède, il est recommandé de ne retenir que les patients présentant un risque élevé ou très élevé de subir une préservation de la fertilité conformément aux directives sur la préservation de la fertilité de la Société nordique d’hématologie et d’oncologiepédiatriques 21. Ce groupe comprend (1) les enfants prépubères et postpubères nécessitant une greffe de cellules souches ou recevant une radiothérapie avec l’ovaire dans le domaine de l’amplitude ampère, et (2) les enfants postpubères recevant de fortes doses cumulatives de chimiothérapie alkylante. Pour les filles avant la ménarche, les critères d’inclusion pour un risque très élevé d’infertilité comprennent celles traitées par l’un des éléments suivants : dose de rayonnement >10 Gy à l’ovaire, ou thérapie par cellules souches hématopoïétiques allogéniques ou autologues (GCSH). Les critères d’exclusion incluent les personnes qui ont besoin de produits sanguins supplémentaires pour d’autres préparations anticoagulantes avant la chirurgie ou qui ont un nombre de neutrophiles 10 Gy à l’ovaire, ou GCSH allogénique, cyclophosphamide >9 g/m², ifosfamide >60 g/m², procarbazine ou composés nitrosourée (BCNU/CCNU) >360 mg/m². Les critères d’exclusion comprennent les personnes présentant un risque accru d’hémorragie, un risque accru d’infection, un risque accru de complications chirurgicales ou un risque accru de problèmes de douleur, tel qu’évalué par le médecin responsable.

Pour les médicaments en vente libre, le tissu ovarien est prélevé lors de chirurgies abdominales par laparotomie ou laparoscopie par ovariectomie unilatérale ou biopsie. La moelle épinière est retirée du tissu ovarien collecté, et le cortex restant est ensuite sectionné en fragments plus petits pour la cryoconservation par congélation à taux contrôlé ou vitrification pour une utilisation ultérieure dans la restauration de la fertilité22. Les échantillons sont ensuite stockés dans de l’azote liquide jusqu’à ce que la patiente se remette de son traitement et souhaite fonder une famille. Selon le type de cancer et en l’absence de contre-indications à la greffe de tissu ovarien, le tissu est ensuite décongelé et auto-greffé pour restaurer la fonction hormonale et ovarienne. L’OTC s’est avéré efficace, avec un taux de grossesse de 50% et plus de 200 naissances vivantes signalées après greffe de tissu ovarien cryoconservé collecté à l’âge adulte 23,24,25. Les naissances vivantes signalées après l’auto-transplantation de tissu ovarien prélevé pendant l’enfance sont rares, et aucune n’a été signalée après l’auto-transplantation de tissu ovarien sans doute prépubère 26,27,28,29,30. La qualité des tissus est une condition préalable à la restauration réussie de la fertilité31. Par conséquent, il est essentiel d’étudier la qualité des échantillons de tissus collectés.

Actuellement, une façon d’estimer la qualité du tissu ovarien est de passer par des coupes histologiques et un comptage manuel des follicules. Cependant, il est difficile d’évaluer la normalité de la densité folliculaire en raison du déclin naturel de la réserve avec l’âge et de la distribution hétérogène des follicules. De plus, la comparaison avec les valeurs de référence est difficile car elles ne sont pas normalisées en fonction de la taille et de l’âge de la biopsie. D’autres options d’évaluation, telles que les taux sériques d’AMH ou la coloration des tissus digérés avec de la calcéine ou du rouge neutre, ne sont pas bien établies ou ont leurs propres limites. Wallace et Kelsey ont précédemment publié un modèle de réserve ovarienne normale au cours de l’âge en recueillant des données sur le nombre de follicules d’ovaires entiers de patientes sans pathologies ovariennesconnues2. De plus, comme les biopsies ne sont pas représentatives de l’ovaire entier, Schmidt et al. ont développé une méthode d’estimation du nombre total de follicules basée sur les biopsies corticales32. À l’aide d’une version modifiée de cette méthode et du modèle de réserve ovarienne normale, un ensemble de données de référence pour la densité folliculaire des femmes âgées de 0 à 25 ans a été établi33.

Cet article décrit la stratégie d’évaluation de la normalité de la densité folliculaire basée sur de petits échantillons ovariens par (1) la quantification directe des follicules à l’aide de l’histologie et (2) la comparaison des résultats avec des références standard normalisées selon l’âge via les scores Z. L’utilisation des scores Z décrit la relation entre la densité folliculaire d’une biopie ovarienne et la moyenne d’un groupe de référence normalisé selon l’âge et la taille. Cela sera d’une grande valeur pour les médecins lorsqu’ils conseillent leurs patients pour l’auto-transplantation et un traitement ultérieur après la préservation de la fertilité.

Protocol

Toutes les procédures menées ont été approuvées par l’Autorité suédoise d’examen éthique (patients Sveafertil, Dnr : 2019-03802) et par le Comité d’éthique de l’hôpital universitaire d’Helsinki (patients HCH, Dnr 340/13/03/03/2015). Des informations écrites et orales sur l’étude ont été fournies par les infirmières de recherche, et le consentement éclairé a été obtenu conformément à la Déclaration d’Helsinki. Pour les patients de moins de 18 ans, le consentement éclairé a été obtenu des tuteurs légaux. Tous les échantillons ont été pseudonymisés et traités conformément au règlement général européen sur la protection des données (RGPD). Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux. 1. Prélèvement et traitement du tissu ovarien REMARQUE : Identifiez tous les patients éligibles à la préservation de la fertilité lorsqu’il existe une indication d’un risque élevé ou très élevé d’infertilité conformément aux directives locales (par exemple, directives spécifiques nordiques, européennes ou internationales). En Europe, recruter des patients mineurs uniquement dans le cadre de programmes de recherche sur la préservation de la fertilité. Déterminez le risque d’infertilité en utilisant les directives de votre pays pour la préservation de la fertilité. Effectuez l’intervention chirurgicale sous anesthésie générale. Administrer par voie intraveineuse du propofol (2 mg/kg), du sufentanil (0,5 microgramme/kg) et du bromure de rocuronium (0,6 mg/kg) pour l’induction de l’anesthésie.Intuber et ventiler le patient avec un volume courant de 6 à 8 mL/kg et une pression expiratoire positive de 6 à 8 cm de H2O. Administrer du sévoflurane de 1 % à 2 % par la sonde endotrachéale pour maintenir l’anesthésie par inhalation. Maintenir le bloc neuromusculaire avec du bromure de rocuronium (0,15 mg/kg) pendant l’intervention chirurgicale pour procurer une relaxation musculaire adéquate et permettre la laparoscopie à des pressions d’insufflation intra-abdominales plus basses. Utilisez l’indice bispectral pour guider la profondeur de l’anesthésique afin de faciliter un réveil rapide avec une dose d’anesthésique réduite. Antagoniser le bloc neuromusculaire résiduel avec le sugammadex (2-4 mg/kg). À l’aide d’une technique à trois ports, insérez un trocart de 10 mm dans la cavité péritonéale au niveau de l’ombilic pour introduire une lentille optique avec une caméra fixée, et deux trocarts de 5 mm dans les régions iliaques gauche et droite (2 cm au-dessus et 2 cm médial de l’épine iliaque antéro-supérieure respective) sous vision directe pour l’instrumentation chirurgicale et le prélèvement tissulaire. Inspectez les organes pelviens, y compris les deux ovaires, pour confirmer la normalité.Identifiez l’ovaire le plus facile d’accès, puis saisissez-le. Coupez un volume d’environ un tiers de l’ovaire (ou tel qu’indiqué dans votre permis éthique), puis utilisez la diathermie, si nécessaire, pour sécuriser l’hémostase.REMARQUE : Effectuez la biopsie uniquement s’il n’y a pas de contre-indications, telles que des facteurs de risque d’hémorragie per- ou postopératoire excessive ou un risque accru d’infection. Précisez clairement et suivez les critères d’inclusion et d’exclusion du pays. L’ovaire entier peut être prélevé si le risque d’infertilité est très élevé et/ou si le risque de couper une partie seulement est considéré comme trop élevé (par exemple, en raison d’un saignement). Évitez d’utiliser la diathermie avant de prélever l’échantillon, car elle peut endommager les tissus. Pendant votre séjour au bloc opératoire, placez le tissu dans un tube contenant 5 ml de 1 tampon phosphate salin (PBS) de Dulbecco avec du CaCl2, du MgCl2, 1 g/L de D-glucose, 36 mg/L de pyruvate, soit réchauffé à 37 °C si l’échantillon est immédiatement traité en laboratoire (dans les 30 minutes), soit maintenu à 4 °C pendant les transports plus longs (jusqu’à 24 h).REMARQUE : Les solutions de transport comprennent une gamme de solutions de transport/perfusion d’organes disponibles dans le commerce, ainsi que des tampons simples tels que PBS et MEM34. Coupez un petit morceau de tissu ovarien (2 mm x 2 mm x 2 mm) de la surface de l’ovaire. Cette pièce contient le cortex, qui est la partie externe de l’ovaire où se trouvent les follicules ovariens35.ATTENTION : Manipulez des tissus humains tels que l’ovaire en utilisant les pratiques et procédures de biosécurité de niveau 2.REMARQUE : Une unité spécialisée en médecine de la reproduction cryoconserve cliniquement le reste du tissu ovarien pour une utilisation future potentielle dans la restauration de la fertilité des patientes. Placez le mouchoir dans une solution de Bouin de 350 μL à température ambiante pendant 2 h ou dans 350 μL de formaldéhyde à 4 °C pendant la nuit, en veillant à ce que le tissu soit complètement immergé. Après l’incubation, lavez trois fois le tissu avec de l’éthanol à 70 %.Pour la solution de Bouin, lavez jusqu’à ce que la couleur jaune disparaisse. Incorporez le tissu dans la cire de paraffine36. Découpez un minimum de 30 coupes de tissu en série d’une épaisseur de 4 μm et placez-les sur des lames de verre.ATTENTION : Manipulez la solution de Bouin et le formaldéhyde à l’intérieur d’une cagoule chimique et avec un équipement de protection approprié.REMARQUE : Le formaldéhyde peut entraîner des artefacts liés au rétrécissement dans les tissus. La solution de Bouin est donc le choix privilégié pour la préservation de l’histologie. Cependant, la solution de Bouin comporte des risques supplémentaires, conduisant plusieurs institutions à préférer l’utilisation du formaldéhyde37. 2. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) Peser 5 g de poudre d’éosine Y dans un flacon en verre autoclavé de 100 ml. Ajouter 800 ml d’éthanol à 95 % et 200 ml d’eau désionisée pour obtenir une solution mère d’éosine à 0,5 %. Préparez une solution de travail à 0,25 % d’éosine en diluant 200 ml de la solution mère d’éosine à 0,5 % avec 160 ml d’éthanol à 100 %, 1 ml d’acide acétique et 40 ml d’eau désionisée.REMARQUE : La poudre peut ne pas se dissoudre complètement. Filtrer la solution avant utilisation pour réduire les précipités. Placez les diapositives sur des grilles. Plongez le support avec les glissières dans les récipients correspondants dans l’ordre suivant : 15 min dans du xylène, 5 min dans 100% d’éthanol, tremper 10 fois dans de l’éthanol 70%, tremper 10 fois dans de l’éthanol à 50%, puis tremper 10 fois dans de l’eau déminéralisée.Immergez le support avec les lames dans une solution d’hématoxyline pendant 3 min, puis transférez le support avec les lames dans un récipient avec de l’eau distillée du robinet pendant 30 s pour éliminer l’excès de tache d’hématoxyline. Placez le support avec les lames dans un récipient avec une solution de différenciation (1 ml de HCl à 37 % ajouté à 100 ml d’éthanol à 70 %) pendant 1 min, puis transférez le support avec les lames dans un récipient avec de l’eau du robinet distillée pendant 30 s.REMARQUE : Assurez-vous que les sections de tissu sont immergées dans le liquide. Ajoutez plus de réactif dans le récipient si nécessaire. Changez le xylène toutes les 5 utilisations lorsque vous colorez de grandes quantités. Préparez de l’éthanol à 50 % en diluant 70 % d’éthanol (p. ex., ajoutez 35 ml d’éthanol à 70 % à 15 ml de DPBS pour obtenir 50 ml d’éthanol à 50 %).ATTENTION : Manipulez le xylène à l’intérieur d’une cagoule et avec un équipement de protection approprié. Placez le support avec les lames dans l’eau du robinet de Scott (également connue sous le nom de solution bleuissante) pendant 30 à 60 s, puis transférez le support avec les lames dans un récipient avec de l’eau du robinet distillée pendant 30 s. Plongez le support avec les lames dans la solution de travail eosin pendant 1 min.Déshydratez les lames en les plaçant dans les réactifs suivants : 100 % d’éthanol pendant 30 s, un second récipient avec 100 % d’éthanol pendant 30 s, puis trempez-les deux fois dans du xylène. Après avoir retiré la grille de la solution de xylène, laissez-la sécher dans un récipient en verre pour éviter que le xylène ne coule à l’intérieur de la hotte. Montez la glissière avec 2 gouttes de solution de montage. Placez soigneusement les glissières du couvercle pour éviter les bulles et laissez sécher la solution de montage.ATTENTION : Manipulez le xylène à l’intérieur d’une cagoule et avec un équipement de protection approprié. Numérisez les diapositives en les numérisant à l’aide de scanners de diapositives si possible. Si cette option n’est pas disponible, utilisez un microscope inversé ordinaire à un grossissement de 20-40x pour compter directement les follicules. Assurez-vous de prendre une image de l’ensemble de la biopsie pour faciliter la mesure de la zone dans un logiciel d’analyse d’images. 3. Comptage des follicules Si les diapositives ont été numérisées, ouvrez les fichiers à l’aide d’un logiciel approprié (p. ex., le logiciel libre QuPath38). S’il n’est pas numérisé, effectuez l’analyse directement à l’aide d’un microscope inversé et de son logiciel respectif.Faites glisser le fichier dans la fenêtre principale de QuPath. Définissez le type d’image sur Brightfield H&E (voir Figure 1A). Définissez à 1 mm de l’épithélium de surface (une seule couche de cellules cuboïdes tapissant la surface) à l’aide de la barre d’échelle. Cliquez sur l’outil ellipse et annotez les follicules (voir Figure 1B). Comptez le nombre de follicules dans cette zone de 1 mm, du stade primordial au stade primaire. Identifiez le stade de chaque follicule (primordial – une couche de cellules de la granulosa aplatie entourant l’ovocyte ; stade intermédiaire – un mélange de cellules de la granulosa aplatie et cuboïde ; primaire – une couche complète de cellules de la granulosa cuboïde entourant l’ovocyte). Entrez l’ID de l’échantillon, l’âge, le nombre de follicules pour chaque lame, l’épaisseur de la section et lanième section comptée dans la feuille nommée Follicule en mm3 sur le fichier Excel du calculateur de score Z du follicule (voir le fichier supplémentaire 1 et la figure 2A).REMARQUE : En raison du diamètre des follicules (plus petits follicules >35 μm), le même follicule peut apparaître en sections consécutives. Faites preuve d’une prudence accrue lorsque vous comptez des sections dont la distance entre les sections est inférieure au diamètre du follicule. De préférence, comptez les follicules de toutes les 10e sections (par exemple, section #10, #20, #30). L’épithélium de surface peut se détacher pendant le traitement des tissus et ne peut être que partiellement présent dans les lames. Ne comptez que les follicules avec un cytoplasme visible. Pour le contrôle de la qualité, demandez à deux personnes de compter indépendamment les follicules et de déterminer dans quelle mesure leurs comptes s’alignent. Calculez la concordance inter-observateurs à l’aide d’une fonction de corrélation simple entre le nombre de follicules de chaque observateur pour le même échantillon. Identifiez les 10 % des follicules les plus grands dans chaque section comptée à l’aide d’un globe oculaire. Mesurez le diamètre moyen de ces ovocytes en cliquant sur l’outil de ligne , en traçant deux lignes perpendiculaires à travers la membrane de l’ovocyte et en sélectionnant Mesurer, puis Afficher les mesures d’annotation (voir Figure 1C).Enregistrez les mesures sous la colonne Longueur μm (voir Figure 1D). Entrez le diamètre moyen de tous les ovocytes dans le champ Diamètre moyen de l’ovocyte (μm) pour chaque lame dans le fichier Excel du calculateur de score z du follicule (follicule en mm3, voir le fichier supplémentaire 1 et la figure 2A). Placez l’image au centre de l’écran dans QuPath, puis cliquez sur l’icône ImageJ . Sélectionnez Envoyer l’instantané à ImageJ (voir Figure 3A). Dans ImageJ, délimitez 1 mm de la bordure à l’aide de l’outil pinceau . Cliquez sur l’image, puis sur Type, et sélectionnez 8 bits (voir Figure 3B).Cliquez sur l’outil Ligne , tracez une ligne sur la barre d’échelle en bas à gauche de l’écran (voir Figure 3C). Cliquez sur Analyser, puis sur Définir l’échelle, saisissez la longueur indiquée dans la barre d’échelle dans le champ Distance connue, puis cliquez sur OK (voir Figure 3C). Cliquez sur Image, puis sur Ajuster, Luminosité/Contraste, puis sélectionnez Auto (voir Figure 3D). Cliquez sur Image, puis sur Ajuster, Seuil, puis sélectionnez Auto (voir Figure 3E). Cliquez sur l’outil baguette , sélectionnez la zone, puis appuyez sur Ctrl + M (voir Figure 3F). Entrez la valeur de l’aire dans le fichier Excel du calculateur de score Z du follicule (follicule en mm3, voir le fichier supplémentaire 1 et la figure 2A). 4. Calculs de la densité folliculaire, du volume cortical et du score Z Utilisez le fichier Excel de la calculatrice de score Z du follicule fourni pour effectuer automatiquement les calculs décrits ci-dessous. Les résultats apparaîtront dans la feuille « Z-score (follicule par mm³) » dans le calculateur Excel (voir le fichier supplémentaire 1), à condition que les détails indiqués au point 3 soient saisis dans la feuille « follicules en mm³ ». Pour calculer les densités folliculaires dans ces sections, utilisez la formule modifiée présentée par Schmidt et al.32. Tout d’abord, appliquez le facteur de correction α pour tenir compte du double comptage du même follicule. La formule modifiée est la suivante :REMARQUE : Dans cette formule, t est l’épaisseur de la section, d est le diamètre de l’ovocyte et q est le quotient du diamètre du follicule divisé par l’épaisseur de la section. Extrapolez le nombre total de follicules (n follicules) dans le cortex à partir du nombre de follicules dans la section en utilisant la formule suivante33 :REMARQUE : Cette formule tient également compte de toutes les sections non calculées. Ici, γ représente le nombre de sections qui ne sont pas calculées (par exemple, γ = 10 si chaque 10e section est comptée), α est le facteur de correction calculé en 4.1, N est le nombre de sections comptées et n i est le nombre total de follicules dans les sections comptées.Extrapolez tout le volume cortical (V) à partir des aires comptées à l’aide de la formule suivante33 :REMARQUE : Ici, Ai est l’aire de la section et ti est l’épaisseur du tissu. Veuillez vérifier l’étape 4.2 pour les γ et N. Utilisez la formule33 suivante pour calculer la densité folliculaire : Déterminez s’il y a une réserve ovarienne réduite (<-1,7 Z-score) en calculant le Z-score à l’aide de la formule33 :REMARQUE : Le score Z est calculé automatiquement dans la feuille « Score Z (follicule par mm³) » de la calculatrice Excel (voir le fichier supplémentaire 1) sur la base des informations fournies à la section 3 (Comptage des follicules) (Figure 2B). Dans cette formule, Z représente le score Z, x est la densité folliculaire calculée (follicules/cm3) de l’échantillon d’étude (étape 4.4), M est la densité folliculaire moyenne du groupe d’âge respectif et SD est l’écart-type du groupe d’âge respectif. Des valeurs de référence pour les femmes âgées de 0 à 25 ans ont été établies dans Hassan et al.33. Les moyennes et les écarts-types des densités folliculaires des groupes d’âge respectifs se trouvent dans le fichier Excel du calculateur de score Z folliculaire (fichier supplémentaire 1) et sont utilisés pour le calcul du score Z.

Representative Results

Les follicules ovariens sont quantifiés après une section, une coloration et un balayage réussis des lames. Les différents stades et la santé des follicules sont distingués et analysés plus en détail. La figure 4A montre une coupe transversale colorée à l’HE d’un ovaire fixé par Bouin provenant d’un adulte, avec des exemples de tissu cortical et médullaire. La figure 4B montre une image représentative de l’o…

Discussion

Les femmes naissent avec un nombre limité d’ovocytes, qui ne peuvent pas être reconstitués. La réserve ovarienne est un déterminant clé du potentiel reproductif d’une femme. Cet article décrit une méthode de quantification histologique de la densité folliculaire et sa comparaison avec des étalons de référence à l’aide des scores Z des densités de follicules corticaux ovariens chez les patientes jeunes et les femmes jusqu’à 25 ans.

Dans c…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier les professionnels de la santé qui nous ont aidés dans le recrutement des participants et la collecte de tissus, ainsi que toutes les patientes qui ont fait don de leurs tissus ovariens. Nous remercions également le Fonds de lutte contre le cancer infantile (PR2020-0096) et le Karolinska Institutet, qui finance le doctorat KID, dont le financement a rendu ce travail possible. Nous tenons également à remercier le service d’analyse morphologique et phénotypique pour la préparation des lames histologiques. Nous remercions Nicola Byers pour la révision linguistique de ce manuscrit.

Materials

1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 14190144
1x Phosphate Buffered Saline w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glucose, 36 mg/L pyruvate  Thermo Fisher 14287-080
37% Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 1.09057.1000
70% ethanol Histolabs 01370.01L
95% ethanol Fisher scientific 10572143
Absolute ethanol Histolabs 01399.01L
Bouin's solution Sigma-Aldrich HT10132-1L
Eosin Y Free acid Sigma-Aldrich E4009-5G 
Formaldehyde Thermo Fisher 28908
Haematoxylin solution according to Delafield Sigma-Aldrich 03971-250ML
ImageJ
Microsoft Excel
Microtome 
Pertex mounting solution  Histolabs 00840-05
Propofol Baxter Holding B.V. N01AX10 ATC-code provided instead of catalog number
QuPath https://qupath.github.io/
Rocuronium bromide  B. Braun Melsungen AG  M03AC09 ATC-code provided instead of catalog number
Scott's tap water substitute concentrate Sigma-Aldrich S5134-6x100ml
Sevoflurane Baxter Medical AB  N01AB08 ATC-code provided instead of catalog number
Slide scanner 
Sufentanil Hameln Pharma gmbh N01AH03 ATC-code provided instead of catalog number
Sugammadex Baxter Holding B.V. V03AB35 ATC-code provided instead of catalog number
SuperFrost plus white  Histolabs  06400 
SuperFrost Plus White microscope slides Histolabs  06400 
Xylene Saveen Werner 131769.1611

References

  1. Richards, J. A. S. The ovarian cycle. Vitam Horm. 107, 1-25 (2018).
  2. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 1-9 (2010).
  3. Monniaux, D., et al. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: What is the link. Biol Reprod. 90 (4), 1-11 (2014).
  4. Gougeon, A., Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. . The early stages of follicular growth in biology and pathology of the oocyte. , 50-61 (2013).
  5. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Ann Endocrinol. 71 (3), 132-143 (2010).
  6. Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and non-growing follicle counts according to the stages of reproductive aging workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
  7. Gold, E. B. The timing of the age at which natural menopause occurs. Obstet Gynecol Clin North Am. 38 (3), 425-440 (2011).
  8. Alberico, H., et al. Workflow optimization for identification of female germline or oogonial stem cells in human ovarian cortex using single-cell RNA sequence analysis. Stem Cells. 40, 523-536 (2022).
  9. White, Y. A. R., et al. Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women. Nat Med. 18 (3), 413-422 (2012).
  10. Wagner, M., et al. Single-cell analysis of human ovarian cortex identifies distinct cell populations but no oogonial stem cells. Nat Commun. 11, 1147 (2020).
  11. Yoshihara, M., et al. In reply: Revisiting claims of the continued absence of functional germline stem cells in adult ovaries. Stem Cells. 41 (2), 205-206 (2023).
  12. Yoshihara, M., et al. The continued absence of functional germline stem cells in adult ovaries. Stem Cells. 41, 105-110 (2023).
  13. Van Kasteren, Y. M., Schoemaker, J. Premature ovarian failure: A systematic review on therapeutic interventions to restore ovarian function and achieve pregnancy. Hum Reprod Update. 5 (5), 483-492 (1999).
  14. McGlacken-Byrne, S. M., Conway, G. S. Premature ovarian insufficiency. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 81, 98-110 (2022).
  15. Viuff, M., Gravholt, C. H. Turner syndrome and fertility. Ann Endocrinol. 83 (4), 244-249 (2022).
  16. Poirot, C., et al. Ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in 418 girls and adolescents up to 15 years of age facing highly gonadotoxic treatment: Twenty years of experience at a single center. Acta Obstet Gynecol Scand. 98 (5), 630-637 (2019).
  17. Jensen, A. K., et al. Cryopreservation of ovarian tissue for fertility preservation in a large cohort of young girls: Focus on pubertal development. Hum Reprod. 32 (1), 154-164 (2017).
  18. The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Fertility preservation in patients undergoing gonadotoxic therapy or gonadectomy: A committee opinion. Fertil Steril. 112 (6), 1022-1033 (2019).
  19. . ART Fact Sheet Available from: https://www.eshre.eu/Press-Room/Resources (2020)
  20. Antonouli, S., et al. A comprehensive review and update on human fertility cryopreservation methods and tools. Front Vet Sci. 10, 1151254 (2023).
  21. Bahroudi, Z., et al. Review of ovarian tissue cryopreservation techniques for fertility preservation. J Gynecol Obstet Hum Reprod. 51 (2), 102290 (2022).
  22. Jensen, A. K., et al. 86 successful births and 9 ongoing pregnancies worldwide in women transplanted with frozen-thawed ovarian tissue: Focus on birth and perinatal outcome in 40 of these children. J Assist Reprod Genet. 34 (3), 325-336 (2017).
  23. Donnez, J., Dolmans, M. -. M. Fertility preservation in women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  24. Dolmans, M. M., Falcone, T., Patrizio, P. Importance of patient selection to analyze in vitro fertilization outcome with transplanted cryopreserved ovarian tissue. Fertil Steril. 114 (2), 279-280 (2020).
  25. Demeestere, I., et al. Live birth after autograft of ovarian tissue cryopreserved during childhood. Hum Reprod. 30 (9), 2107-2109 (2015).
  26. Ernst, E., Kjærsgaard, M., Birkebæk, N. H., Clausen, N., Andersen, C. Y. Case report: Stimulation of puberty in a girl with chemo- and radiation therapy-induced ovarian failure by transplantation of a small part of her frozen/thawed ovarian tissue. Eur J Cancer. 49 (4), 911-914 (2013).
  27. Rodriguez-Wallberg, K. A., et al. Successful pregnancies after transplantation of ovarian tissue retrieved and cryopreserved at time of childhood acute lymphoblastic leukemia – a case report. Haematologica. 106 (10), 2783-2787 (2021).
  28. Matthews, S. J., Picton, H., Ernst, E., Andersen, C. Y. Successful pregnancy in a woman previously suffering from β-thalassemia following transplantation of ovarian tissue cryopreserved before puberty. Minerva Ginecol. 70 (4), 432-435 (2018).
  29. Kristensen, S. G., et al. Use of cryopreserved ovarian tissue in the Danish fertility preservation cohort. Fertil Steril. 116 (4), 1098-1106 (2021).
  30. Donfack, N. J., et al. Expectations and limitations of ovarian tissue transplantation. Zygote. 25 (4), 391-403 (2017).
  31. Schmidt, K. L. T., Byskov, A. G., Andersen, A. N., Müller, J., Andersen, C. Y. Density and distribution of primordial follicles in single pieces of cortex from 21 patients and in individual pieces of cortex from three entire human ovaries. Hum Reprod. 18 (6), 1158-1164 (2003).
  32. Hassan, J., et al. Reference standards for follicular density in ovarian cortex from birth to sexual maturity. Reprod Biomed Online. 47, 103287 (2023).
  33. Vilela, J. d. e. M. V., Dolmans, M. M., Amorim, C. A. Ovarian tissue transportation: A systematic review. Reprod Biomed Online. 42 (2), 351-365 (2021).
  34. Gibson, E., Mahdy, H. . Anatomy, abdomen and pelvis, ovary. , (2023).
  35. Nagaraj, A. S., et al. Establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing. J Vis Exp. (141), e58569 (2018).
  36. Adeniran, B. V., Bjarkadottir, B. D., Appeltant, R., Lane, S., Williams, S. A. Improved preservation of ovarian tissue morphology that is compatible with antigen detection using a fixative mixture of formalin and acetic acid. Hum Reprod. 36 (7), 1871-1890 (2021).
  37. Bankhead, P., et al. QuPath: Open-source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 1-7 (2017).
  38. Björvang, R. D., et al. Persistent organic pollutants and the size of ovarian reserve in reproductive-aged women. Environ Int. 155, 106589 (2021).
  39. Kwok, R., Johnson, N. P. Ovarian biopsy has no role as a routine diagnostic test of ovarian reserve: A systematic review. Reprod Biomed Online. 24, 492-495 (2012).
  40. Ahmad, A., et al. High-throughput spatial sensitive, quantitative phase microscopy using low spatial and high temporal coherent illumination. Sci Rep. 11 (1), 1-13 (2021).

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Citer Cet Article
Hassan, J., Damdimopoulou, P., Lahtinen, A., Jahnukainen, K., Knuus, K., Acharya, G., Björvang, R. D. Z-Scores for Assessing Ovarian Reserve in Young Patients Undergoing Fertility Preservation. J. Vis. Exp. (212), e66504, doi:10.3791/66504 (2024).

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