Le présent protocole décrit une méthode d’évaluation de la réserve ovarienne chez les patientes de moins de 25 ans qui nécessitent une préservation de la fertilité par cryoconservation du tissu ovarien. Cette méthode implique : (1) l’évaluation histologique de la réserve ovarienne dans les échantillons corticaux, (2) la comparaison avec un ensemble de données de référence, et (3) le calcul des scores Z.
Les femmes naissent avec un pool non renouvelable de follicules ovariens, appelé réserve ovarienne. Cette réserve se compose de follicules primordiaux dans les ovaires et peut être affectée par de nombreux facteurs, tels que des troubles génétiques et endocriniens, des interventions médicales et des perturbateurs endocriniens. La préservation de la fertilité est recommandée lorsque des traitements gonadotoxiques sont nécessaires. Les options préférées des femmes sont la cryoconservation des ovocytes et des embryons. Cependant, chez les patientes très jeunes et sexuellement immatures, la cryoconservation du tissu ovarien est la seule option. Connaître la densité folliculaire des échantillons de tissus cryoconservés est essentiel dans le conseil en fertilité pour les jeunes patients. Ce protocole démontre l’utilisation des Z-scores pour la densité folliculaire corticale comme outil d’évaluation de la qualité du tissu ovarien chez les filles et les jeunes femmes âgées de 25 ans et moins qui subissent une préservation de la fertilité. La densité folliculaire dans les échantillons de patients est comparée aux étalons de référence normalisés selon l’âge, développés par Hassan et al. pour estimer les écarts possibles par rapport à l’étalon. La densité folliculaire est mesurée par quantification histologique. Pour cela, un petit morceau de tissu cortical ovarien (~2 mm x 2 mm x 2 mm) est fixé dans une solution de Bouin ou de formaldéhyde, noyé dans de la paraffine, sectionné à 4 μm d’épaisseur, coloré à l’hématoxyline et à l’éosine, et numérisé à l’aide d’un scanner de lames. Les stades folliculaires présents dans le cortex vont des follicules primordiaux aux follicules primaires. La zone corticale était à 1 mm de l’épithélium de surface sur les coupes histologiques. La densité folliculaire est calculée à l’aide d’une formule modifiée présentée par Schmidt et al., et le score Z est déterminé à l’aide de la moyenne de référence et de l’écart-type. Le score Z indique dans quelle mesure la valeur mesurée s’écarte de la moyenne de référence, déterminant la réserve ovarienne réduite (<-1,7 score Z). Avec cette méthode, les densités folliculaires peuvent être utilisées comme une mesure précieuse de la réserve ovarienne pour les jeunes patientes nécessitant une préservation de la fertilité.
L’ovaire est un organe dynamique, actif sur le plan endocrinologique, composé d’un cortex externe et d’une moelle épinière interne. Les follicules sont répartis de manière hétérogène dans les ovaires, qui contiennent l’ovocyte gonadique entouré de cellules de la granulosa stromale1. Tous les follicules sont déjà formés au cours du développement fœtal, culminant vers 20 semaines d’âge gestationnel, suivi d’un déclin exponentiel. À la naissance, 1 à 2 millions de follicules primordiaux restent dans le cortex, et seulement quelques centaines de milliers de follicules survivent jusqu’à la puberté2. Le pool de follicules non en croissance, également appelé réserve ovarienne, influence la fertilité d’une femme, entre autres facteurs. La réserve ovarienne réside dans le cortex et se déplace dans la moelle à mesure que les follicules grandissent et mûrissent. Certains chercheurs reconnaissent que la réserve ovarienne est composée uniquement de follicules primordiaux, tandis que d’autres comprennent tous les follicules unilaminaires (c’est-à-dire primordiaux, intermédiaires et primaires)3,4,5,6. Au cours de la vie d’une femme, seuls 300 à 400 follicules mûrissent et survivent pour finalement subir l’ovulation. La ménopause commence lorsque le nombre de follicules tombe à environ un millier, ce qui se produit généralement vers 50 ans ou 7 ans. Il y a actuellement un débat en cours concernant la présence de cellules souches oogoniennes (CSO) dans les ovaires humains adultes qui peuvent former des ovocytes après une xénotransplantation. Certaines études suggèrent d’isoler des cellules qui expriment un profil génétique de cellules germinales primitives et se différencient en ovocytes 8,9, tandis que d’autres indiquent que les OSC présumés sont des cellules périvasculaires des vaisseaux sanguins 10,11,12.
L’insuffisance ovarienne prématurée (POI) se définit par l’arrêt du cycle menstruel avec une élévation du taux de FSH avant l’âge de 40 ans13. Les causes de l’IOP sont multifactorielles et peuvent survenir de manière idiopathique ; Cependant, il survient souvent à la suite de conditions médicales14. Par exemple, certaines maladies génétiques congénitales sont associées à la POI en raison d’une réserve ovarienne réduite dès la naissance, comme le syndrome de Turner15. Le POI peut également survenir en tant qu’effet secondaire des traitements gonadotoxiques, ce qui est particulièrement problématique chez les très jeunes patientes car il peut entraîner une incapacité à subir une puberté normale et altérer considérablement la réserve ovarienne. En fonction du risque de POI et de l’âge de la patiente, plusieurs options de préservation de la fertilité sont disponibles, telles que la cryoconservation d’ovocytes matures, la cryoconservation d’embryons après fécondation in vitro et la cryoconservation de tissus ovariens (OTC). Pour les patientes prépubères, l’OTC est la seule option réalisable en raison de leur immaturité sexuelle16,17. Aux États-Unis, la préservation de la fertilité par le biais d’un médicament en vente libre a récemment été considérée comme une routine clinique acceptable18. Cependant, l’OTC est encore considéré comme expérimental dans de nombreux pays européens, et une approbation éthique est requise, en particulier pour l’auto-transplantation19,20. Par conséquent, les critères d’inclusion des protocoles en vente libre doivent être soigneusement examinés et une analyse risques-avantages doit être effectuée pour chaque patient. Tous les enfants recevant des thérapies gonadotoxiques ne sont pas éligibles à la préservation de la fertilité. En Suède, il est recommandé de ne retenir que les patients présentant un risque élevé ou très élevé de subir une préservation de la fertilité conformément aux directives sur la préservation de la fertilité de la Société nordique d’hématologie et d’oncologiepédiatriques 21. Ce groupe comprend (1) les enfants prépubères et postpubères nécessitant une greffe de cellules souches ou recevant une radiothérapie avec l’ovaire dans le domaine de l’amplitude ampère, et (2) les enfants postpubères recevant de fortes doses cumulatives de chimiothérapie alkylante. Pour les filles avant la ménarche, les critères d’inclusion pour un risque très élevé d’infertilité comprennent celles traitées par l’un des éléments suivants : dose de rayonnement >10 Gy à l’ovaire, ou thérapie par cellules souches hématopoïétiques allogéniques ou autologues (GCSH). Les critères d’exclusion incluent les personnes qui ont besoin de produits sanguins supplémentaires pour d’autres préparations anticoagulantes avant la chirurgie ou qui ont un nombre de neutrophiles 10 Gy à l’ovaire, ou GCSH allogénique, cyclophosphamide >9 g/m², ifosfamide >60 g/m², procarbazine ou composés nitrosourée (BCNU/CCNU) >360 mg/m². Les critères d’exclusion comprennent les personnes présentant un risque accru d’hémorragie, un risque accru d’infection, un risque accru de complications chirurgicales ou un risque accru de problèmes de douleur, tel qu’évalué par le médecin responsable.
Pour les médicaments en vente libre, le tissu ovarien est prélevé lors de chirurgies abdominales par laparotomie ou laparoscopie par ovariectomie unilatérale ou biopsie. La moelle épinière est retirée du tissu ovarien collecté, et le cortex restant est ensuite sectionné en fragments plus petits pour la cryoconservation par congélation à taux contrôlé ou vitrification pour une utilisation ultérieure dans la restauration de la fertilité22. Les échantillons sont ensuite stockés dans de l’azote liquide jusqu’à ce que la patiente se remette de son traitement et souhaite fonder une famille. Selon le type de cancer et en l’absence de contre-indications à la greffe de tissu ovarien, le tissu est ensuite décongelé et auto-greffé pour restaurer la fonction hormonale et ovarienne. L’OTC s’est avéré efficace, avec un taux de grossesse de 50% et plus de 200 naissances vivantes signalées après greffe de tissu ovarien cryoconservé collecté à l’âge adulte 23,24,25. Les naissances vivantes signalées après l’auto-transplantation de tissu ovarien prélevé pendant l’enfance sont rares, et aucune n’a été signalée après l’auto-transplantation de tissu ovarien sans doute prépubère 26,27,28,29,30. La qualité des tissus est une condition préalable à la restauration réussie de la fertilité31. Par conséquent, il est essentiel d’étudier la qualité des échantillons de tissus collectés.
Actuellement, une façon d’estimer la qualité du tissu ovarien est de passer par des coupes histologiques et un comptage manuel des follicules. Cependant, il est difficile d’évaluer la normalité de la densité folliculaire en raison du déclin naturel de la réserve avec l’âge et de la distribution hétérogène des follicules. De plus, la comparaison avec les valeurs de référence est difficile car elles ne sont pas normalisées en fonction de la taille et de l’âge de la biopsie. D’autres options d’évaluation, telles que les taux sériques d’AMH ou la coloration des tissus digérés avec de la calcéine ou du rouge neutre, ne sont pas bien établies ou ont leurs propres limites. Wallace et Kelsey ont précédemment publié un modèle de réserve ovarienne normale au cours de l’âge en recueillant des données sur le nombre de follicules d’ovaires entiers de patientes sans pathologies ovariennesconnues2. De plus, comme les biopsies ne sont pas représentatives de l’ovaire entier, Schmidt et al. ont développé une méthode d’estimation du nombre total de follicules basée sur les biopsies corticales32. À l’aide d’une version modifiée de cette méthode et du modèle de réserve ovarienne normale, un ensemble de données de référence pour la densité folliculaire des femmes âgées de 0 à 25 ans a été établi33.
Cet article décrit la stratégie d’évaluation de la normalité de la densité folliculaire basée sur de petits échantillons ovariens par (1) la quantification directe des follicules à l’aide de l’histologie et (2) la comparaison des résultats avec des références standard normalisées selon l’âge via les scores Z. L’utilisation des scores Z décrit la relation entre la densité folliculaire d’une biopie ovarienne et la moyenne d’un groupe de référence normalisé selon l’âge et la taille. Cela sera d’une grande valeur pour les médecins lorsqu’ils conseillent leurs patients pour l’auto-transplantation et un traitement ultérieur après la préservation de la fertilité.
Les femmes naissent avec un nombre limité d’ovocytes, qui ne peuvent pas être reconstitués. La réserve ovarienne est un déterminant clé du potentiel reproductif d’une femme. Cet article décrit une méthode de quantification histologique de la densité folliculaire et sa comparaison avec des étalons de référence à l’aide des scores Z des densités de follicules corticaux ovariens chez les patientes jeunes et les femmes jusqu’à 25 ans.
Dans c…
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier les professionnels de la santé qui nous ont aidés dans le recrutement des participants et la collecte de tissus, ainsi que toutes les patientes qui ont fait don de leurs tissus ovariens. Nous remercions également le Fonds de lutte contre le cancer infantile (PR2020-0096) et le Karolinska Institutet, qui finance le doctorat KID, dont le financement a rendu ce travail possible. Nous tenons également à remercier le service d’analyse morphologique et phénotypique pour la préparation des lames histologiques. Nous remercions Nicola Byers pour la révision linguistique de ce manuscrit.
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
1x Phosphate Buffered Saline w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glucose, 36 mg/L pyruvate | Thermo Fisher | 14287-080 | |
37% Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 1.09057.1000 | |
70% ethanol | Histolabs | 01370.01L | |
95% ethanol | Fisher scientific | 10572143 | |
Absolute ethanol | Histolabs | 01399.01L | |
Bouin's solution | Sigma-Aldrich | HT10132-1L | |
Eosin Y Free acid | Sigma-Aldrich | E4009-5G | |
Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
Haematoxylin solution according to Delafield | Sigma-Aldrich | 03971-250ML | |
ImageJ | |||
Microsoft Excel | |||
Microtome | |||
Pertex mounting solution | Histolabs | 00840-05 | |
Propofol | Baxter Holding B.V. | N01AX10 | ATC-code provided instead of catalog number |
QuPath | https://qupath.github.io/ | ||
Rocuronium bromide | B. Braun Melsungen AG | M03AC09 | ATC-code provided instead of catalog number |
Scott's tap water substitute concentrate | Sigma-Aldrich | S5134-6x100ml | |
Sevoflurane | Baxter Medical AB | N01AB08 | ATC-code provided instead of catalog number |
Slide scanner | |||
Sufentanil | Hameln Pharma gmbh | N01AH03 | ATC-code provided instead of catalog number |
Sugammadex | Baxter Holding B.V. | V03AB35 | ATC-code provided instead of catalog number |
SuperFrost plus white | Histolabs | 06400 | |
SuperFrost Plus White microscope slides | Histolabs | 06400 | |
Xylene | Saveen Werner | 131769.1611 |