El presente protocolo describe un método para evaluar la reserva ovárica en pacientes menores de 25 años que requieren preservación de la fertilidad mediante criopreservación de tejido ovárico. Este método implica: (1) la evaluación histológica de la reserva ovárica en muestras corticales, (2) la comparación con un conjunto de datos de referencia y (3) el cálculo de las puntuaciones Z.
Las mujeres nacen con un grupo no renovable de folículos ováricos, lo que se conoce como reserva ovárica. Esta reserva está formada por folículos primordiales de los ovarios y puede verse afectada por muchos factores, como trastornos genéticos y endocrinos, intervenciones médicas y disruptores endocrinos. Se recomienda la preservación de la fertilidad cuando son necesarios tratamientos gonadotóxicos. Las opciones preferidas para las mujeres son la criopreservación de ovocitos y embriones. Sin embargo, en pacientes muy jóvenes y sexualmente inmaduras, la criopreservación de tejido ovárico es la única opción. Conocer la densidad folicular de las muestras de tejido criopreservado es esencial en el asesoramiento sobre fertilidad de pacientes jóvenes. Este protocolo demuestra el uso de puntuaciones Z para la densidad del folículo cortical como herramienta para evaluar la calidad del tejido ovárico en niñas y mujeres jóvenes de 25 años o menos que están en proceso de preservación de la fertilidad. La densidad de folículos en muestras de pacientes se compara con los estándares de referencia normalizados por edad, desarrollados por Hassan et al. para estimar las posibles desviaciones del estándar. La densidad del folículo se mide a través de la cuantificación histológica. Para ello, se fija un pequeño trozo de tejido cortical ovárico (~2 mm x 2 mm x 2 mm) en solución de Bouin o de formaldehído, se incrusta en parafina, se secciona a 4 μm de grosor, se tiñe con hematoxilina y eosina y se digitaliza con un escáner de portaobjetos. Las etapas foliculares presentes en la corteza van desde los folículos primordiales hasta los primarios. El área cortical estaba a 1 mm del epitelio superficial en los cortes histológicos. La densidad de folículos se calcula utilizando una fórmula modificada presentada por Schmidt et al., y la puntuación Z se determina utilizando la media de referencia y la desviación estándar. La puntuación Z indica cuánto se desvía el valor medido de la media de referencia, determinando la reserva ovárica reducida (<-1,7 puntuación Z). Con este método, las densidades de los folículos se pueden utilizar como una medida valiosa de la reserva ovárica para pacientes jóvenes que requieren preservación de la fertilidad.
El ovario es un órgano dinámico, endocrinológicamente activo, formado por una corteza externa y una médula interna. Dentro de los ovarios se distribuyen heterogéneamente los folículos, que contienen el ovocito gonadal rodeado de células estromales de la granulosa1. Todos los folículos ya se forman durante el desarrollo fetal, alcanzando su punto máximo alrededor de las 20 semanas de edad gestacional, seguido de una disminución exponencial. Al nacer, 1-2 millones de folículos primordiales permanecen dentro de la corteza, y solo unos pocos cientos de miles de folículos sobreviven hasta la pubertad2. El acervo de folículos que no crece, también conocido como reserva ovárica, influye en la fertilidad de la mujer, entre otros factores. La reserva ovárica reside dentro de la corteza y se mueve hacia la médula a medida que los folículos crecen y maduran. Algunos investigadores reconocen que la reserva ovárica está compuesta únicamente por folículos primordiales, mientras que otros incluyen todos los folículos unilaminares (es decir, primordial, intermediario y primario)3,4,5,6. Durante la vida de una mujer, solo 300-400 folículos maduran y sobreviven para finalmente sufrir la ovulación. La menopausia comienza cuando el número de folículos desciende a alrededor de mil, lo que generalmente ocurre alrededor de los 50 años de edad 2,7. Actualmente existe un debate en curso sobre la presencia de células madre oogoniales (OSC) en ovarios humanos adultos que pueden formar ovocitos después de un xenotrasplante. Algunos estudios sugieren aislar células que expresan un perfil genético de células germinales primitivas y se diferencian en ovocitos 8,9, mientras que otros indican que las supuestas OSC son células perivasculares de los vasos sanguíneos 10,11,12.
La insuficiencia ovárica prematura (IOP) se define por la interrupción del ciclo menstrual con niveles elevados de FSH antes de los 40 años13. Las causas de la IOP son multifactoriales y pueden ocurrir de forma idiopática; sin embargo, a menudo surge como resultado de condiciones médicas14. Por ejemplo, ciertas condiciones genéticas congénitas se asocian con POI debido a una reserva ovárica reducida ya en el nacimiento, como el síndrome de Turner15. La POI también puede ocurrir como un efecto secundario de los tratamientos gonadotóxicos, lo cual es particularmente problemático en pacientes muy jóvenes, ya que puede conducir a una incapacidad para experimentar una pubertad normal y afectar drásticamente la reserva ovárica. Dependiendo del riesgo de IOP y de la edad de la paciente, existen varias opciones de preservación de la fertilidad, como la criopreservación de ovocitos maduros, la criopreservación de embriones después de la fertilización in vitro y la criopreservación de tejido ovárico (OTC). Para los pacientes prepúberes, la OTC es la única opción factible debido a su inmadurez sexual 16,17. En los Estados Unidos, la preservación de la fertilidad a través de OTC ha sido considerada recientemente como una rutina clínica aceptable18. Sin embargo, la OTC todavía se considera experimental en muchos países europeos, y se requiere aprobación ética, particularmente para el autotrasplante19,20. Por lo tanto, los criterios de inclusión para los protocolos de venta libre deben considerarse cuidadosamente y se debe realizar un análisis de riesgo-beneficio para cada paciente. No todos los niños que reciben terapias gonadotóxicas son elegibles para la preservación de la fertilidad. En Suecia, solo se recomienda que los pacientes con riesgo alto o muy alto se sometan a la preservación de la fertilidad de acuerdo con las directrices sobre la preservación de la fertilidad de la Sociedad Nórdica de Hematología y Oncología Pediátrica21. Este grupo incluye (1) niños prepúberes y pospúberes que requieren trasplante de células madre o que reciben radioterapia con el ovario en el campo de rango, y (2) niños pospúberes con dosis acumulativas altas de quimioterapia alquilante. Para las niñas antes de la menarquia, los criterios de inclusión para el riesgo muy alto de infertilidad incluyen aquellas tratadas con cualquiera de los siguientes tratamientos: dosis de radiación >10 Gy al ovario, o terapia alogénica o autóloga con células madre hematopoyéticas (TCMH). Los criterios de exclusión incluyen a aquellos que necesitan productos sanguíneos adicionales para otras preparaciones anticoagulantes antes de la cirugía o que tienen un recuento de neutrófilos 10 Gy al ovario, o TCMH alogénico, ciclofosfamida >9 g/m², ifosfamida >60 g/m², procarbazina o compuestos de nitrosourea (BCNU/CCNU) >360 mg/m². Los criterios de exclusión incluyen aquellos con un mayor riesgo de sangrado, mayor riesgo de infección, mayor riesgo de complicaciones quirúrgicas o mayor riesgo de problemas de dolor según lo evaluado por el médico a cargo.
En el caso de la venta libre, el tejido ovárico se recolecta durante las cirugías abdominales mediante laparotomía o laparoscopia mediante ooforectomía unilateral o biopsia. La médula se extrae del tejido ovárico recolectado y la corteza restante se secciona en fragmentos más pequeños para la criopreservación mediante congelación o vitrificación a tasa controlada para su uso posterior en la restauración de la fertilidad22. Luego, las muestras se almacenan en nitrógeno líquido hasta que la paciente se recupera de su tratamiento y desea formar una familia. Dependiendo del tipo de cáncer y en ausencia de contraindicaciones para el trasplante de tejido ovárico, el tejido se descongela y se autoinjerta para restaurar la función hormonal y ovárica. La OTC ha demostrado ser exitosa, con una tasa de embarazo del 50% y más de 200 nacidos vivos reportados después del injerto de tejido ovárico criopreservado recolectado durante la edad adulta 23,24,25. Los nacidos vivos reportados después del autotrasplante de tejido ovárico recolectado durante la infancia son pocos, y ninguno ha sido reportado después del autotrasplante de tejido ovárico indudablemente prepuberal 26,27,28,29,30. La calidad de los tejidos es un requisito previo para el éxito de la restauración de la fertilidad31. Por lo tanto, es fundamental estudiar la calidad de las muestras de tejido recolectadas.
En la actualidad, una forma de estimar la calidad del tejido ovárico es a través de cortes histológicos y recuento manual de los folículos. Sin embargo, es difícil evaluar la normalidad de la densidad folicular debido a la disminución natural de la reserva con el aumento de la edad y a la distribución heterogénea de los folículos. Además, la comparación con los valores de referencia es un desafío, ya que no están estandarizados para el tamaño y la edad de la biopsia. Otras opciones de evaluación, como los niveles séricos de AMH o la tinción del tejido digerido con calceína o rojo neutro, no están bien establecidas o tienen sus propias limitaciones. Wallace y Kelsey publicaron previamente un modelo de reserva ovárica normal a lo largo de la edad mediante la recopilación de datos sobre el número de folículos de ovarios enteros de pacientes sin patologías ováricas conocidas2. Además, dado que las biopsias no son representativas de todo el ovario, Schmidt et al. desarrollaron un método para estimar el número total de folículos basado en biopsias corticales32. Utilizando una versión modificada de este método y el modelo de reserva ovárica normal, se estableció un conjunto de datos de referencia para la densidad de folículos de mujeres de 0 a 25 años33.
Este artículo describe la estrategia para evaluar la normalidad de la densidad de folículos basada en muestras ováricas pequeñas mediante (1) la cuantificación directa de los folículos mediante histología y (2) la comparación de los resultados con referencias estándar normalizadas por edad a través de puntuaciones Z. El uso de puntuaciones Z describe la relación de la densidad de folículos de una biopsia ovárica con una media de grupo de referencia estandarizada por edad y tamaño. Esto será de gran valor para los médicos a la hora de aconsejar a sus pacientes para el autotrasplante y el tratamiento posterior después de la preservación de la fertilidad.
Las mujeres nacen con un grupo finito de ovocitos, que no se pueden reponer. La reserva ovárica es un determinante clave del potencial reproductivo de una mujer. En este artículo se describe un método para la cuantificación histológica de la densidad folicular y su comparación con los estándares de referencia utilizando puntuaciones Z de las densidades de folículos corticales ováricos en pacientes jóvenes y mujeres de hasta 25 años de edad.
En este …
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a los profesionales de la salud que nos ayudaron con el reclutamiento de participantes y la recolección de tejidos y a todas las pacientes que donaron su tejido ovárico. También reconocemos al Fondo de Cáncer Infantil (PR2020-0096) y al Instituto Karolinska PhD que financia KID, cuya financiación hizo posible este trabajo. También nos gustaría agradecer al servicio de Análisis de Fenotipos Morfológicos por la preparación de las láminas histológicas. Agradecemos a Nicola Byers por la edición lingüística de este manuscrito.
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
1x Phosphate Buffered Saline w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glucose, 36 mg/L pyruvate | Thermo Fisher | 14287-080 | |
37% Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 1.09057.1000 | |
70% ethanol | Histolabs | 01370.01L | |
95% ethanol | Fisher scientific | 10572143 | |
Absolute ethanol | Histolabs | 01399.01L | |
Bouin's solution | Sigma-Aldrich | HT10132-1L | |
Eosin Y Free acid | Sigma-Aldrich | E4009-5G | |
Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
Haematoxylin solution according to Delafield | Sigma-Aldrich | 03971-250ML | |
ImageJ | |||
Microsoft Excel | |||
Microtome | |||
Pertex mounting solution | Histolabs | 00840-05 | |
Propofol | Baxter Holding B.V. | N01AX10 | ATC-code provided instead of catalog number |
QuPath | https://qupath.github.io/ | ||
Rocuronium bromide | B. Braun Melsungen AG | M03AC09 | ATC-code provided instead of catalog number |
Scott's tap water substitute concentrate | Sigma-Aldrich | S5134-6x100ml | |
Sevoflurane | Baxter Medical AB | N01AB08 | ATC-code provided instead of catalog number |
Slide scanner | |||
Sufentanil | Hameln Pharma gmbh | N01AH03 | ATC-code provided instead of catalog number |
Sugammadex | Baxter Holding B.V. | V03AB35 | ATC-code provided instead of catalog number |
SuperFrost plus white | Histolabs | 06400 | |
SuperFrost Plus White microscope slides | Histolabs | 06400 | |
Xylene | Saveen Werner | 131769.1611 |