本プロトコルは、卵巣組織の凍結保存による妊孕性温存を必要とする 25 歳未満の患者の卵巣予備能を評価する方法を説明しています。この方法には、(1) 皮質サンプル中の卵巣予備能の組織学的評価、(2) 参照データセットとの比較、および (3) Z スコアの計算が含まれます。
女性は、卵巣予備能と呼ばれる再生不可能な卵巣卵胞のプールを持って生まれます。この予備力は卵巣の原始卵胞で構成されており、遺伝性疾患や内分泌障害、医学的介入、内分泌かく乱物質など、多くの要因の影響を受ける可能性があります。性腺毒性治療が必要な場合は、生殖能力の保存が推奨されます。女性に好ましい選択肢は、卵子と胚の凍結保存です。しかし、非常に若く性的に未熟な患者では、卵巣組織の凍結保存が唯一の選択肢です。凍結保存された組織サンプルの卵胞密度を知ることは、若年患者の不妊治療カウンセリングに不可欠です。このプロトコルは、25 歳以下の少女および若年女性の卵巣組織の質を評価するためのツールとして、皮質卵胞密度の Z スコアの使用を示しています。患者サンプルの卵胞密度は、標準からの逸脱の可能性を推定するためにHassanらによって開発された年齢正規化された参照標準と比較されます。卵胞密度は、組織学的定量化によって測定されます。このために、卵巣皮質組織の小片(~2 mm x 2 mm x 2 mm)をブイン溶液またはホルムアルデヒド溶液に固定し、パラフィンに包埋し、厚さ4 μmで切片化し、ヘマトキシリンとエオシンで染色し、スライドスキャナーを使用してデジタル化します。皮質に存在する卵胞期は、原始卵胞から一次卵胞までさまざまです。皮質領域は、組織切片の表面上皮から1mmでした。卵胞密度は、Schmidtらによって提示された修正式を使用して計算され、Zスコアは参照平均と標準偏差を使用して決定されます。Zスコアは、測定値が参照平均からどれだけ逸脱しているかを示し、卵巣予備能の減少(<-1.7 Zスコア)を決定します。この方法により、卵胞密度は、妊孕性の維持を必要とする若い患者の卵巣予備能の貴重な尺度として使用できます。
卵巣は、外側の皮質と内側の髄質からなる、動的で内分泌的に活動的な器官です。卵巣内に不均一に分布しているのは卵胞であり、卵胞には間質顆粒膜細胞1に囲まれた性腺卵子が含まれています。すべての卵胞は胎児の発育中にすでに形成されており、妊娠期間の約20週でピークに達し、その後指数関数的に減少します。出生時には、100万〜200万個の原始卵胞が皮質内に残り、思春期まで生き残るのは数十万個の卵胞だけです2。成長していない卵胞プールは、卵巣予備能とも呼ばれ、他の要因の中でも特に女性の生殖能力に影響を与えます。卵巣予備能は皮質内に存在し、卵胞が成長して成熟するにつれて髄質に移動します。一部の研究者は、卵巣予備能が原始卵胞のみで構成されていると認識していますが、他の研究者はすべての単層卵胞(すなわち、原始卵胞、中間卵胞、および一次卵胞)を含む3,4,5,6。女性の生涯の間に、300〜400個の卵胞だけが成熟し、最終的に排卵を経験するために生き残ります。更年期障害は、卵胞の数が約1000に減少したときに始まり、通常は約50歳で発生します2,7。現在、異種移植後に卵母細胞を形成する可能性のある成人ヒト卵巣における卵原幹細胞(OSC)の存在について、議論が続いています。いくつかの研究は、原始生殖細胞の遺伝子プロファイルを発現し、卵母細胞に分化する細胞を単離することを示唆している8,9が、他の研究は、主張されているOSCが血管の血管周囲細胞であることを示している10,11,12。
早発卵巣機能不全(POI)は、40歳より前にFSHレベルが上昇した月経周期の中止によって定義されます13。POIの原因は多因子性であり、特発性で発生する可能性があります。しかし、それはしばしば病状の結果として発生します14。たとえば、ターナー症候群15のように、出生時にすでに卵巣予備能が減少しているため、特定の先天性遺伝的状態がPOIに関連しています。POIは、性腺毒性治療の副作用としても発生する可能性があり、これは正常な思春期を経ることができず、卵巣予備能を劇的に損なう可能性があるため、非常に若い患者では特に問題です。POIのリスクと患者の年齢に応じて、成熟卵子の凍結保存、体外受精後の胚の凍結保存、卵巣組織凍結保存(OTC)など、いくつかの受胎能保存オプションが利用可能です。思春期前の患者にとって、OTCは彼らの性的未熟さのために唯一の実行可能な選択肢です16,17。米国では、OTCによる妊孕性保存は最近、許容可能な臨床ルーチンと見なされています18。しかし、OTCは多くのヨーロッパ諸国ではまだ実験的であると考えられており、特に自家移植には倫理的承認が必要です19,20。したがって、OTCプロトコルの選択基準を慎重に検討し、各患者に対してリスク・ベネフィット分析を実施する必要があります。性腺毒性療法を受けているすべての子供が妊孕性温存の対象となるわけではありません。スウェーデンでは、リスクが高いまたは非常に高い患者のみが、北欧小児血液腫瘍学会の妊孕性保存に関するガイドラインに従って妊孕性温存を受けることが推奨されています21。このグループには、(1)幹細胞移植を必要とする、または範囲の領域で卵巣による放射線療法を受けている思春期前および思春期後の子供、および(2)アルキル化化学療法の累積用量が高い思春期後の子供が含まれます。初潮前の女児の場合、不妊症のリスクが非常に高い場合の選択基準には、次のいずれかで治療されたものが含まれます:卵巣への放射線量>10Gy、または同種または自家造血幹細胞療法(HSCT)。除外基準には、手術前に他の抗凝固剤製剤に追加の血液製剤が必要な人、または好中球数が10Gy、または同種HSCT、シクロホスファミド>9 g /m²、イホスファミド>60 g /m²、プロカルバジン、またはニトロソ尿素化合物(BCNU / CCNU)>360 mg /m²。除外基準には、担当医が評価した出血リスクの増加、感染リスクの増加、外科的合併症のリスクの増加、または痛みの問題のリスクの増加があるものが含まれます。
OTCの場合、卵巣組織は、開腹術または腹腔鏡検査による腹部手術中に、片側卵巣摘出術または生検によって採取されます。髄質は、収集された卵巣組織から除去され、残りの皮質は、その後、生殖能力回復22で使用するために、制御された速度凍結またはガラス化を通じて凍結保存のために小さな断片に切片化される。その後、サンプルは、患者が治療から回復し、家族を始めることを希望するまで、液体窒素に保存されます。がんの種類にもよりますが、卵巣組織移植に対する禁忌がない場合、組織は解凍され、ホルモンと卵巣の機能を回復させるために自家移植されます。OTCは成功していることが証明されており、成人期に採取された凍結保存された卵巣組織の移植後に50%の妊娠率と200人以上の出生が報告されています23,24,25。小児期に採取された卵巣組織の自己移植後の出生報告は少なく、間違いなく思春期前の卵巣組織の自己移植後の出生は報告されていない26,27,28,29,30。組織の質は、生殖能力の回復を成功させるための前提条件です31。したがって、収集された組織サンプルの品質を研究することが不可欠です。
現在、卵巣組織の質を推定する方法は、組織学的切片と卵胞の手動カウントによるものです。ただし、卵胞密度の正規性を評価することは、年齢の増加に伴う予備力の自然な減少と卵胞の不均一な分布のために困難です。さらに、参照値との比較は、生検のサイズと年齢が標準化されていないため、困難です。AMHの血清レベルや、カルセインやニュートラルレッドによる消化組織の染色など、他の評価オプションは十分に確立されていないか、独自の制限があります。Wallace と Kelsey は以前に、既知の卵巣病変を持たない患者の全卵巣から卵胞数に関するデータを収集することにより、年齢を超えた正常な卵巣予備能のモデルを発表しました2.さらに、生検は卵巣全体を代表しているわけではないため、Schmidtらは皮質生検32に基づいて卵胞の総数を推定する方法を開発した。この方法の修正版と正常な卵巣予備能のモデルを使用して、0〜25歳の女性の卵胞密度の参照データセットが確立された33。
この記事では、(1)組織学を使用した卵胞の直接定量化、および(2)Zスコア による 年齢正規化標準参照との結果の比較により、小さな卵巣サンプルに基づいて卵胞密度の正規性を評価するための戦略について説明します。Zスコアの使用は、卵巣バイオピーの卵胞密度と年齢およびサイズで標準化された参照グループ平均との関係を表します。これは、医師が患者に自己移植や妊孕性保存後のさらなる治療についてカウンセリングする際に大きな価値があります。
女性は生まれつき有限の卵子のプールを持っており、それを補充することはできません。卵巣予備能は、女性の生殖能力の重要な決定要因です。この記事では、卵胞密度の組織学的定量方法と、若年患者と 25 歳までの女性における卵巣皮質卵胞密度の Z スコアを使用した参照標準との比較方法について概説します。
このプロトコルでは、卵巣組…
The authors have nothing to disclose.
参加者の募集と組織採取に協力してくださった医療従事者の皆様、そして卵巣組織を提供してくださったすべての患者様に感謝いたします。また、この活動を可能にしたKIDに資金を提供したChildhood Cancer Fund(PR2020-0096)とKarolinska Institutet PhDにも感謝します。また、組織学的スライドの作成にご協力いただいたMorphological Phenotype Analysis施設にも感謝いたします。この原稿を言語校正してくれたNicola Byersに感謝します。
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
1x Phosphate Buffered Saline w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glucose, 36 mg/L pyruvate | Thermo Fisher | 14287-080 | |
37% Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 1.09057.1000 | |
70% ethanol | Histolabs | 01370.01L | |
95% ethanol | Fisher scientific | 10572143 | |
Absolute ethanol | Histolabs | 01399.01L | |
Bouin's solution | Sigma-Aldrich | HT10132-1L | |
Eosin Y Free acid | Sigma-Aldrich | E4009-5G | |
Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
Haematoxylin solution according to Delafield | Sigma-Aldrich | 03971-250ML | |
ImageJ | |||
Microsoft Excel | |||
Microtome | |||
Pertex mounting solution | Histolabs | 00840-05 | |
Propofol | Baxter Holding B.V. | N01AX10 | ATC-code provided instead of catalog number |
QuPath | https://qupath.github.io/ | ||
Rocuronium bromide | B. Braun Melsungen AG | M03AC09 | ATC-code provided instead of catalog number |
Scott's tap water substitute concentrate | Sigma-Aldrich | S5134-6x100ml | |
Sevoflurane | Baxter Medical AB | N01AB08 | ATC-code provided instead of catalog number |
Slide scanner | |||
Sufentanil | Hameln Pharma gmbh | N01AH03 | ATC-code provided instead of catalog number |
Sugammadex | Baxter Holding B.V. | V03AB35 | ATC-code provided instead of catalog number |
SuperFrost plus white | Histolabs | 06400 | |
SuperFrost Plus White microscope slides | Histolabs | 06400 | |
Xylene | Saveen Werner | 131769.1611 |