ניתן להעריך את תפקוד שרירי השלד על ידי כימות ההתכווצות של סיבי שריר מבודדים, באופן מסורתי באמצעות גישות מייגעות בעלות תפוקה נמוכה. במאמר זה אנו מתארים שיטה מבוססת אופטיקה בעלת תפוקה גבוהה לכימות ההתכווצות של סיבי שריר משובצים בהידרוג’ל. לגישה זו יש יישומים לסינון תרופות ופיתוח טיפולי.
תרבית תאים במבחנה היא כלי רב עוצמה להערכת תהליכים תאיים ולבדיקת אסטרטגיות טיפוליות. עבור שרירי השלד, הגישות הנפוצות ביותר כוללות התמיינות של תאי אב מיוגנים לצינורות שריר לא בשלים או תרבית ex vivo לטווח קצר של סיבי שריר בודדים מבודדים. יתרון מרכזי של תרבית ex vivo על פני מבחנה הוא שימור הארכיטקטורה התאית המורכבת ומאפייני ההתכווצות. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול ניסיוני לבידוד סיבי שריר שלמים של flexor digitorum brevis מעכברים ותרבית ex vivo שלהם לאחר מכן. בפרוטוקול זה, סיבי השריר מוטמעים בהידרוג’ל מטריצת ממברנה מבוססת פיברין ומרתף כדי לשתק את הסיבים ולשמור על תפקוד ההתכווצות שלהם. לאחר מכן אנו מתארים שיטות להערכת תפקוד התכווצות סיבי השריר באמצעות מערכת כיווץ מבוססת אופטיקה בעלת תפוקה גבוהה. סיבי השריר המשובצים עוברים גירוי חשמלי כדי לגרום להתכווצויות, ולאחר מכן התכונות התפקודיות שלהם, כגון קיצור סרקומר ומהירות התכווצות, מוערכות באמצעות כימות מבוסס אופטיקה. צימוד תרבית סיבי שריר עם מערכת זו מאפשר בדיקות תפוקה גבוהה של ההשפעות של חומרים פרמקולוגיים על תפקוד התכווצות ומחקרי ex vivo של הפרעות שרירים גנטיות. לבסוף, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם גם לחקר תהליכים תאיים דינמיים בסיבי שריר באמצעות מיקרוסקופ תאים חיים.
ההתקדמות בטכניקות תרביות תאי מבחנה פתחה אפשרויות חדשות לחקר יכולות התחדשות רקמות, מנגנונים תאיים פתופיזיולוגיים ואסטרטגיות טיפוליות עוקבות, כל זאת תוך שימוש ברקמות יונקים בתנאים מבוקרים היטב 1,2,3. השימוש במערכות תרבית חוץ גופית מבוסס היטב בתחום מחקר השרירים 4,5. באופן כללי, במבחנה מובחנת myotubes בוגר מתאי אב מיוגנים משמשים 2,6,7,8. למרות שהושגה התקדמות בפרוטוקול ההתמיינות ליצירת סיבי שריר בוגרים יותר9, חוסר הבשלות שלהם עדיין מגביל את תרגום הממצאים להגדרה in vivo 1,10. נושא מרכזי אחד בתחום הביולוגיה של השריר הוא חוסר היכולת של צינורות מיו-צינור ממוינים במבחנה למצות באופן מלא את המבנים התוך-תאיים המורכבים, תהליכי איתות התא והאינטראקציות החוץ תאיות שנצפו ברקמת שריר טבעית, וחשוב מכך, לשחזר את כוחות ההתכווצות המיוצרים על ידי סיבי שריר 1,2,10,11,12 . בנוסף, ההתכווצות הבלתי מתואמת של צינוריות השריר במהלך תהליך ההתמיינות גורמת לעיתים קרובות לניתוק ספונטני ממנות התרבית, מה שהופך את הערכת ההתכווצות של מיוצינוריות מובחנות במבחנה למאתגרת ומוגבלת להערכה איכותית או כמותית למחצה 8,11,12,13. מגבלות אלה מחייבות לעתים קרובות ניסויים קבועים in vivo עם בעלי חיים, במיוחד אם התכווצות שרירים היא תוצאת ניסוי עיקרית1.
חלופה לגידול בצינורות מיו-צינור מובחנים היא תרבית ex vivo של סיבי שריר בוגרים מבודדים 1,14. במהלך תרבית ex vivo, רקמת שריר בוגרת התפתחותית נכרתת מהגוף, ואחריה בידוד תא בודד לגידול בתנאי מעבדה 1,14. סיבי השריר הבוגרים המבודדים שומרים על המבנים התאיים המורכבים שלהם שנצפו ברקמה הטבעית14,15, ושיטה זו פותחת את האפשרות להתערבויות ישירות, כגון מניפולציה גנטית ובדיקת תרופות, בסביבת תרבית מוגדרת היטב וניתנת לשליטה. אחד הדיווחים הראשונים על בידוד סיבי שריר השלד ותרבות ex vivo מתוארך לשנות השלושים; עם זאת, התפוקה של סיבים ברי קיימא מפרוטוקול זה הייתה נמוכה16. עם אופטימיזציה מתמשכת של הליך הבידוד ותנאי התרבית, שיפור משמעותי בכמות סיבי השריר קיימא ומתפקדים אפשרי כעת 14,15,17,18,19. שיפור אחד כזה בתנאי התרבית כרוך בציפוי צלחות תרבית בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים כדי לקדם את היצמדות סיבי השריר המבודדים לצלחת התרבית15,18,20. בדרך כלל, ציפוי למינין משמש, שכן למינין הוא אחד המרכיבים הנפוצים ביותר בתוך מטריצה תאית של שרירים20,21. האופטימיזציה של הליך הבידוד בשילוב עם ציפוי צלחות התרבית אפשרו לשדה מחקר השרירים לשמור על סיבי שריר מבודדים בני קיימא עם ארכיטקטורה תאית שלמה ופונקציונליות כיווץ בתרבית לפרקי זמן קצרים 1,15,18,22.
הגישה הקונבנציונלית ביותר המשמשת בתחום השרירים למדידת כוח ויכולות כיווץ היא הרכבת סיבי שריר בודדים בין מנוע נהג אורך ומתמר כוח23,24. באופן כללי, סיבי השריר המשמשים למערכים מוטוריים אלה מנותחים מרקמה קפואה או טרייה, ולאחר מכן חלחול או “עור”, המאפשר הפעלת סידן חיצונית, כאשר ריכוזי סידן משתנים משמשים לגרימת התכווצות סיבי שריר24. בעוד ששיטה זו היא תקן הזהב למדידות התכווצות סיבי שריר, ניתן למדוד רק סיב שריר אחד בכל פעם, מה שהופך טכניקה זו להליך מייגע וגוזל זמן25. יתר על כן, הליך הבידוד והעור של סיבי השריר משבש את המבנים השונים המעורבים בצימוד עירור-התכווצות (כלומר, שחרור סידן וספיגה מחדש לאחר מכן לתוך הרשתית הסרקופלזמית), ובכך אינו מאפשר מחקר של קינטיקה הרפיה וכל מחלה שעלולה להשפיע על תהליך זה26,27. חלופה להכנת סיבי העור היא שימוש בדיסקציה מכנית לבידוד סיבי שריר שלמים, שם ניתן למדוד כוחות התכווצות בתגובה להפעלה חשמלית28; עם זאת, גישה זו מאתגרת מבחינה טכנית וגוזלת זמן רב, וכתוצאה מכך מדידות בתפוקה נמוכה. לבסוף, הן בתכשירים בעלי עור והן בתכשירים שלמים, תאי השריר מוסרים לחלוטין מהסביבה החוץ תאית במהלך מדידות התכווצות 24, מה שהופך את חקירת ההשפעה של הרכב/נוקשות המטריקס החוץ תאי על התכווצות סיבי השרירלבלתי אפשרית24. כתוצאה מכך, יש צורך בפיתוח שיטות חלופיות שיאפשרו מדידות התכווצות סיבי שריר של סיבי שריר שלמים מבודדים באופן בתפוקה גבוהה תוך שחזור הקשר בין סיבי השריר למטריצה החוץ תאית.
לאחרונה פותחה גישה חדשה מבוססת אופטיקה למדידות התכווצות סיבי שריר בתפוקה גבוהה29. מערכת אופטית זו מודדת את המחזוריות של סרקומרים כדי להעריך את אורך הסרקומר במהלך התכווצות באמצעות הדמיה במהירות גבוהה. בתוך מערכת זו, התאים נשארים במקומם בצלחת התרבית בזמן שהאופטיקה זזה, ובכך ממזערים את הזמן הדרוש בין מדידות של תאים מרובים29. יתרון מרכזי של שימוש בגישה מבוססת אופטיקה זו בתפוקה גבוהה הוא שהיא מאפשרת לפתח תנאי תרבית הדומים לאלה של הרקמה המקומית. גישה המשמשת לחיקוי תנאי invivo טבעיים היא הטמעת תאים בהידרוג’לים30. בדרך כלל, הידרוג’ל הוא חומר ויסקו-אלסטי המסוגל לשמור על נפחו וצורתו, ולהידרוג’לים יש תכונות של חומרים מוצקים ונוזליים כאחד31. החלק המוצק מורכב משרשראות פולימריות המקושרות זו לזו, ויוצרות מבנה שנראה דומה לרשת30,31. ניתן לכוונן את תכונות החומר של הידרוג’לים כדי לחקות את שקיעת המטריקס של השרירים30,31. לפיכך, השילוב של מערכת מבוססת אופטיקה בעלת תפוקה גבוהה עם תאים המשובצים בהידרוג’לים פותח אפשרויות חדשות להעריך את ההשפעות של הרכב מטריצה חוץ-תאית ותכונות מכניות על תפקוד סיבי השריר.
המטרה הכוללת של מאמר זה היא 1) לתאר את המתודולוגיה לבידוד אנזימטי ולתרבית ex vivo של סיבי שריר בתנאים המחקים את סביבת הרקמה הטבעית ו-2) להעריך את התכווצות סיבי השריר באמצעות גישה בעלת תפוקה גבוהה. אנו מתארים מתודולוגיה מפורטת לבידוד קל של מספר רב של סיבי שריר בודדים משריר ה-FDB (flexor digitorum brevis) באמצעות עיכול אנזימטי. בנוסף, אנו מתארים טכניקה להטמעת סיבי השריר המבודדים בהידרוג’ל על בסיס פיברין לצורך חיקוי הסביבה הטבעית של השרירים ושיפור הכדאיות וההתכווצות של סיבי השריר. לאחר מכן אנו מתארים שיטה בעלת תפוקה גבוהה למדידת התכווצויות סיבי שריר חיים במבחנה באמצעות מערכת זו שפותחה לאחרונה. יתרון נוסף של הליך הטבעה זה הוא אימוביליזציה של סיבים במהלך התכווצות, מה שעשוי לשפר את יחס האות לרעש של מדידות אלה. שיטת הטבעה זו של ג’ל ישימה הן עבור פולימר יחיד והן עבור הליכי אנקפסולציה של ג’ל מרוכב, ומקלה על הערכת ההשפעות של הרכב מטריצה חוץ-תאית על התכווצות סיבי השריר.
כאן, אנו מפרטים פרוטוקול לביצוע בידוד אנזימטי ותרבית של סיבי שריר FDB בפורמט תרבית תלת מימדית, ואחריו מדידות התכווצות באמצעות מערכת מדידת כיווץ מבוססת אופטיקה. לפרוטוקול זה מספר יתרונות, כולל 1) בידוד ישיר ובזמן של סיבי שריר שלמים רבים משריר יחיד; 2) הטבעה של סיבי השריר במטריצת הידרוג’ל מתכווננת; 3) ביצוע מדידות התכווצות בתפוקה גבוהה באמצעות המערכת מבוססת האופטיקה; 4) היכולת לבצע מדידות חוזרות ונשנות של אותם סיבי שריר לאחר התערבות. הבידוד של סיבי שריר חיים בודדים מספק תאי שריר בוגרים השומרים על תפקוד ההתכווצות שלהם. מכיוון שסיבי השריר המתקבלים מה- FDB של העכבר קטנים יחסית, הם ניתנים למניפולציה בקלות במהלך הבידוד ושומרים על צורתם הישרה, מה שמאפשר מדידות כיווץ במורד הזרם. למרות שהמערכת פותחה בעיקר כדי לחקור התכווצות קרדיומיוציטים, סיבי שרירי השלד מכילים את אותה מנגנון כיווץ עם דפוס סרקומר שניתן להבחין בו בקלות, ולכן ניתן למדוד אותם גם באמצעות מערכת זו29. הצימוד של מדידות התכווצות של תא בודד עם תרבית סיבי שריר חיה ex vivo הוא כלי רב עוצמה להערכת הבריאות והתפקוד של סיבי שריר בוגרים בתגובה להפעלה חשמלית.
מגבלה בשימוש בסיבי שריר מנותקים היא היעדר כוחות חיצוניים (כלומר, מתיחה פסיבית) המופעלים על הסיבים, מה שמביא לאורכי סרקומר נמוכים יותר במנוחה בהשוואה לאלה הנמצאים in vivo. למרות שאורך סרקומר של 2.4-2.5 מיקרומטר מבטיח ייצור כוח אופטימלי, אורך הסרקומר במנוחה יכול להשתנות מאוד33. בעוד שאורך הסרקומר במנוחה in vivo של ה-FDB טרם תואר, הנתונים שלנו שלא פורסמו מצביעים על אורך ממוצע של 2.2 מיקרומטר. התוצאות הנוכחיות מראות אורך סרקומר ממוצע במנוחה של ~1.95 מיקרומטר בסיבי FDB פרוקים לאחר 24 שעות בתרבית (איור 3). למרות שאורך סרקומר מנוחה נמוך זה יגרום לייצור כוח נמוך יותר, אורך של ~1.95 מיקרומטר עדיין אמור לייצר >90% מהכוח המרבי34. לכן, אורכי סרקומר אלה צריכים להספיק כדי לקבוע הבדלים בתפקוד הסיבים בין מודלים גנטיים שונים או בעקבות טיפולים תרופתיים. בנוסף, הטבעה של סיבים בהידרוג’ל מספקת נקודות רבות נוספות להידבקות בהשוואה לסיבים דו-ממדיים צפים חופשיים, מה שיגביל את התקצרות נוספת של סרקומר לאורך זמן.
אחד היתרונות של פרוטוקול בידוד סיבי שריר זה הוא השימוש בשריר מהיר קל לניתוח המורכב מסיבי שריר קטנים יחסית בהשוואה לשרירים אחרים, כגון extensor digitorum longus (EDL). גודלם הקטן יותר הופך את בידוד השרירים למתאים יותר להפרדה מבוססת טריטורציה, ובכך מקטין את הסיכוי לנזק הנגרם על ידי פיפט או סבך לסיבי השריר. המטריצה החוץ תאית של שרירי FDB ניתנת לעיכול אנזימטי בקלות עם collagenase, ומאפשרת בידוד של מאות סיבי שריר בפרק זמן קצר. עם זאת, עיכול יתר עלול להוביל לנזק לסיבי השריר. ניתן לזהות את עיכול היתר של סיבי השריר כאשר השריר מתפרק כמעט מיד בעת טריטוציה של השריר או כאשר חלק גדול מנפח התא מתכווץ יתר על המידה במהלך הליך זריעת התא. כדי למנוע עיכול יתר של השריר, זמן העיכול צריך להיות אופטימלי עבור כל אצווה collagenase. כדי לבדוק זאת, שני שרירי FDB צריכים להיות מעוכלים במקביל לזמן עיכול מדורג של 5 דקות ביניהם. יש לבחור את זמן העיכול עם התשואה הגבוהה ביותר של סיבי שריר קיימא. לאחר מכן יש לבצע אופטימיזציה זו פעם נוספת, שוב עם 5 דקות של הפרדה בזמן העיכול. יש להשתמש בזמן העיכול המניב את סיבי השריר בעלי יכולת הקיימא הגבוהה ביותר כזמן העיכול האופטימלי עבור אצווה הנוכחית של collagenase. דרך נוספת להגביל את השונות בין אצווה לאצווה של collagenase תהיה לחשב ישירות את יחידות הפעילות למיליליטר של תמיסת מלאי ולאחר מכן לשחזר את אצוות collagenase הבאות לאותה כמות. לבסוף, ייתכן שיהיה צורך למטב את זמני העיכול בין זני עכברים שונים, לדוגמה, אם חוקרים בעלי חיים זקנים או חולים המציגים שקיעת מטריצה חוץ-תאית מוגברת35,36.
האפשרות של צנרת סיבי שריר מבודדים קיימא פותחת אפשרויות לתרבית סיבי שריר FDB בתנאי תרבית שונים. אפשרות אחת כזו היא גידול סיבים אלה בהידרוג’לים כדי לחקות את סביבת תרבית הרקמה המקומית. פרוטוקול הטבעה זה מבטיח שהסיבים יישארו במקומם במהלך מדידות ההתכווצות ועבר אופטימיזציה כדי לאפשר לסיבים לשקוע לתחתית הצלחת לפני שהג’ל שוקע. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להתאים פרוטוקול זה כדי להתאים להבדלים במלאי הטרומבין והפיברינוגן. אם פעילות הטרומבין גבוהה מדי, הג’ל ישקע בטרם עת, והסיבים עשויים להישאר תלויים במקומות גבוהים יותר מחוץ למישור המוקד של המיקרוסקופ. אם זה קורה, יחס טרומבין:פיברינוגן צריך להיות מותאם. ניתן לבדוק זאת על ידי ציפוי סיבים בריכוזי טרומבין נמוכים יותר ויותר ולשים לב כמה זמן לוקח הפילמור. בדרך כלל, זה לא אמור לקרות מהר יותר מ -30 דקות. עם זאת, ריכוז תרומבין נמוך מדי עלול גם לפגוע בתהליך פילמור. שיטה נוספת לוודא שהסיבים נמצאים במישור המוקד הנכון היא לזרוע אותם תחילה באמצעות פרוטוקול דו-ממדי ולאחר מכן להוסיף שכבת הידרוג’ל על הסיבים לאחר שהם נצמדו לצלחת התרבית. עם זאת, יש להיות מודעים לכך שהסרת התווך מהסיבים עלולה לגרום להתכווצות יתר, שכן הם רגישים להתייבשות. כמו כן, לא ברור אם ההידרוג’ל יתחבר במלואו לצלחת התרבית, והוא עשוי להשתחרר בקלות רבה יותר. לכן, הליך הטמעה זה עדיף לשמירה על סיבים בני קיימא ובמקום למדידות התכווצות.
השימוש בפרוטוקול זה מאפשר לחקור את דינמיקת ההתכווצות של סיבי שריר בוגרים ex vivo וניתן ליישם אותו הן על עכברים בריאים והן על אלה הנושאים מוטציות גנטיות למחלות שרירים. כמו כן, הוא מאפשר לבחון כיצד תנאי תרבית או תוספת של תרכובות משפיעים על תפקוד סיבי השריר. נתוני ההתכווצות המתקבלים באמצעות המערכת מבוססת האופטיקה נותנים אינדיקציה ליכולת ההתכווצות של סיבי שריר בודדים חיים, ושינויים ביכולת זו יכולים להיות מתואמים לבריאות הסיבים. עם זאת, נתונים אלה לבדם אינם מספיקים כדי לקבוע אם שינויים אלה מתרחשים בשלבי הגישור הצולב, אקטין מיוזין או שחרור סידן של התכווצות שרירים. למרות שאיננו מתארים שיטות למדידת איתות סידן בפרוטוקול זה, מערך זה מסוגל גם למדוד מעברי סידן מבוססי פורה בתאי שריר מתכווצים29. החיסרון של מערכת זו הוא ששריר FDB מכיל רק סיבי שריר מסוג IIa/IIx מהירים, ושרירים המכילים סיבים מסוג I בגודל זה טרם תוארו37. זה מבטל את היכולת לחקור תפקוד ספציפי לסוג הסיבים באמצעות שיטה זו. הפרוטוקול שאנו מציעים כאן יכול להיות מותאם באופן פוטנציאלי לשרירים אחרים כגון EDL או הסולאוס כדי לחקור הבדלים בין סוגי סיבים. בשל גודלם הגדול יותר, פרוטוקול זה יצטרך להיות מותאם עוד יותר עבור שרירים אלה. סיבים ארוכים יותר נוטים להסתבך במהלך שלב שקיעת הכבידה וייקרעו אם יטופלו על ידי פיפט, מה שיוביל ליבול נמוך יותר. בשל חוסר התאימות שלהם עם pipetting, סיבים ארוכים יותר, ולכן, הם גם פחות תואמים את טכניקת הטבעה ג’ל. מדידות של סיבים אלה עדיין יכולות להיעשות בפורמט תרבית דו-ממדית, אך הסיבים עשויים לנוע יותר במהלך ההתכווצות בשל גודלם, ובכך להשפיע על יחס האות לרעש. מגבלה נוספת של מערכת זו היא חוסר היכולת לבצע מדידות כוח לצד מדידות הכיווץ, כגון מדידות הכוח שניתן לקבל באמצעות תכשירים אחרים מסיבי שריר שלמים28. עם זאת, מגבלה זו ניתן לעקוף על ידי הערכת הכוח שנוצר על ידי סיבי השריר. ניתן להעריך את הכוח שנוצר של סיבי השריר אם צורת סיבי השריר במהלך מצבים מכווצים ורגועים, כמו גם מודולוס יאנג של המטריצה, ידועים25. עם זאת, מערכת אופטית זו מספקת גישה קלה לשימוש ובעלת תפוקה גבוהה לחקר תפקוד כיווץ השרירים ופותחת מגוון אפשרויות חדשות לחקר מחלות שרירים גנטיות והתערבויות טיפוליות.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות לסילביה בוגארדס, סאנה לואיקס, ולנטיין ינסן, מיכאל הלמס ואמי מנדרס על מומחיותם הטכנית בסיוע בפיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי פרסים מהאגודה לניוון שרירים (פרס פיתוח MDA603238 לטי.ג’יי.קיי), הברית הקרדיווסקולרית ההולנדית (מענק כישרון לטי.ג’יי.קיי), והמועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC, אוסטרליה; המלגה APP1121651 למ”י).
Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Equipment | |||
24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
MyoPacer | IonOptix | N/a | |
SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
Vannas Spring Scissor – 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
Software | |||
CytoSolver | IonOptix | N/a | |
IonWizard | IonOptix | N/a |