光学系を用いたヒドロゲル包埋無傷マウス筋線維のハイスループット収縮測定(英語)

生体外収縮研究では、死後組織は、オランダの動物研究法の許可により、欧州理事会指令(2010/63 / EU)に従って、他の承認された研究プロジェクトおよび/またはVU大学の余剰繁殖のために犠牲にされた動物から取得されました。 1.材料の準備 摩砕用のピペットを準備します(使用するまでフローキャビネット内の70%エタノールに保管します)。2つのP1,000チップの端をカットして、異なる穴サイズを作成します。穴がピペットを塞ぐことなく筋肉が通過するのに十分な大きさであることを確認してください。カットの端を炎に通して滑らかになるようにします。 他の箇所32に記載されているようにシルガード皿を準備し、隔離中に足と筋肉を固定するために事前に70%エタノールで滅菌します。注意: シルガードディッシュは、脱イオン水と70%エタノールで徹底的に洗浄した後、再利用できます。 単離手順の前に、解剖培地、フィブリン培養培地、および筋肉消化培地( 表1を参照)の溶液を調製してください。注意: 筋肉消化培地は、0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌する必要があります。調製したすべての溶液は、標準的な細胞培養インキュベーターで37°C、5%CO2で、使用前に少なくとも30分間平衡化する必要があります。 筋肉消化後、ヒドロゲルをキャストするために次の溶液を調製します:セルミックスとマトリックスミックス( 表2を参照)。セルミックスとマトリックスミックスを1:1の比率で組み合わせて、最終的なフィブリン濃度を2.5 mg/mLにします。注意: 氷上でマトリックスを準備し、予冷したピペットチップを使用して、基底膜マトリックスの早期重合を防ぎます。ここで使用したトロンビン:フィブリノーゲン比1:10(フィブリノーゲンmgあたりの単位)は、重合時間30分に最適化されています。ゲルが30分以内に重合する場合は、より低いトロンビン濃度を使用する必要があります。詳細については、ディスカッションを参照してください。 2. FDB筋解離 頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。後肢を70%アルコールで消毒します。 足首の上の下肢を切り取ります。足の背側の皮膚をつま先に向かって切り開きます。注意: 後で必要になった場合に下肢の筋肉や脛骨が損傷するのを防ぐために、足首関節で下肢の後肢を切り取ります。 つま先に向かって皮膚を慎重にはがします。筋肉を傷つけないように注意してください。FDBは、足の腹側にある最も表面的な筋肉です。 解剖した足を、37°Cで予熱した解剖培地10mLを入れたシルガード皿に入れます。 つま先にまだ付着している皮膚を通して足を固定し、足首を超えて下肢を固定します。 筋肉の上の結合組織を慎重に取り除きます。かかとで腱を切り、その腱で筋肉を持ち上げます。 結合組織を通して筋肉の横と下を切断します。つま先の腱が露出するまで切り続けます。 3つの腱の長さの半分が露出したら、腱を切り、足から筋肉を解放します。オプション:4番目の外側腱とその筋線維を切り取ります。 筋肉から結合組織を取り除き、予熱した解剖培地を含むチューブに移します。 3.FDB筋肉消化 表1に従って筋肉消化培地を調製する。 血清学的ピペットを用いてFDB筋肉を筋肉消化培地に移す。組織培養インキュベーター内で37°C、5%CO2 で80分間インキュベートします。注:この時間は、コラゲナーゼバッチごとに最適化する必要があります。筋肉がほつれ始め、肥大して見えると消化が完了します。消化時間の最適化については、説明を参照してください。 消化後、3 mLの解剖培地を含む15 mLチューブに筋肉を移し、30分間インキュベートしてから摩砕します。 4. FDB筋粉砕と重力沈降 事前に準備した粉砕チップ(ステップ1.1)を使用して、筋肉をピペッティングして、最大サイズから最小サイズに筋肉を粉砕します。このステップに5分以上かかる場合は、筋肉をインキュベーターに5分間入れて休ませます。 筋繊維がほとんど腱から外れ、腱がP200の先端を通過できるようになるまで粉砕します。腱を取り除きます。 解離したFDBファイバーを10 mLの解剖培地を含む15 mLチューブに加え、ファイバーをインキュベーター内で20分間沈降させます。形成されたペレットを観察します。 オプション:上部から10mLの培地を取り出し、手順4.3を繰り返します。このステップは、過剰な破片および関連する単核細胞の除去を容易にする。 5. FDBファイバー埋め込み 繊維ペレットの上部からすべての培地を慎重に取り除きます。FDB筋肉あたり875 μLの細胞ミックスに細胞を再懸濁します(氷上)。注:1つのFDB筋は、24ウェルプレートの7ウェルに十分な繊維を生成します。この密度は、実験の必要性に応じて調整することができる。以下のゲル容量(250 μL)は、24ウェルフォーマット用に最適化されていますが、他のフォーマットに合わせてスケーリングできます。 125 μLの細胞混合物を単一の微量遠心チューブに分注します。 1ウェルずつ、125 μLのマトリックスミックスを細胞懸濁液アリコートに加え、気泡が形成されないように慎重に上下にピペッティングして混合します。 すぐに最終ミックスをウェルに移します。注意: 必ず混合物をウェルの中央にピペットで入れてください。各ウェルについて、ステップ5.3とステップ5.4を繰り返します。 ゲルをインキュベーター内で30〜45分間固化させる。固化後、培養液をウェルに慎重に加えます。注:高速ピペッティングにより、ヒドロゲルをウェルから剥離させることができます。この時点から、繊維を刺激して測定することができます。しかし、私たちの経験では、繊維を24時間培養条件に調整させることで、繊維の収縮性が向上する可能性があります。 より長い培養の場合は、2日ごとに半分交換して培地を補充します。これを行うには、培養液の半分を取り除き、等量の新鮮な培地と交換します。 6. 光学ベースの収縮測定 光学ベースの収縮測定システム(材料表を参照)、蛍光ランプ、電気セルペーサー、およびコンピューターの電源を入れます。電気刺激装置を1.0 Hz、10.0 V、および5.00 msのパルス持続時間に設定して、孤立した筋線維を刺激します。 プレートを測定システムに挿入します。ペーサーをペーシングインサートに接続し、培養プレートに挿入します。 IonWizardプログラムを開き、ファイル(画面左上)をクリックして新しいファイルを開きます |新規。 プログラムが正しい実験、骨格サルコメアにあるかどうかを確認するには、[新規]をクリックします。実験を収集します。テストを変更するには、目的のテストをクリックし、[追加] を押します。骨格サルコメア実験では、Sarc 20x、平均ライン、シングルFFT、250 Hzサンプリングレート、および10秒の取得時間の設定を適用します。注意: 実験設定は、実験の前に準備する必要があります。設定は、実験のニーズに合わせて調整できます。 測定システムの温度を 25°Cに調整します。ツールバーの下にある 開いているセルファインダー をクリックし、新しい画面がポップアップするのを待ちます。この画面の右上で、 プレートタイプ と アクティブウェルを選択します。注:測定は25°Cで行われ、速けいれんFDB筋線維の収縮速度を低下させ、収縮イベントのアンダーサンプリングを防ぎます。 フォーカススライダーバーを調整して、ファイバーに焦点を合わせます。または、このフォーカス機能にはWキーとSキーを使用します。 ペーシングを有効にして電気刺激を開始します。繊維がけいれんし始めるのを観察します。注意: 繊維がけいれんしていない場合は、すべてのワイヤーが接続され、ペーサーが完全に水没していることを確認してください。この後も動きがない場合は、粉砕中の過剰消化または過度の損傷のために繊維が反応しない可能性があります。 サルコメアが垂直に走るように、測定領域をファイバーの端に焦点を合わせます。サルコメアに焦点が合っていることを確認してください。サルコメアに焦点が合っている場合は、ツールバーに単一のピークが表示されます。収縮中、サルコメアが短くなるにつれて、このピークは右に移動します。注意: 紫色の測定領域は、実験を開始する前に調整できます。適切な測定を確実にするために、~20個のサルコメアを含めます。このピークが収縮中に形状を変える場合、これは収縮中にサルコメアが不明瞭または焦点が合っていないことを示している可能性があり、ノイズが発生します。 ツールバーの [開始 ] をクリックして実験を開始します。 Q キーを押して測定を開始し、プログラムが10個の収縮過渡現象を測定するのを待ちます。4つ以上のトランジェントにノイズがないように見える場合は、 Z キーを押して測定を受け入れます。トランジェントのノイズが多すぎる場合は、 X キーを押して測定を拒否します。 条件ごとに10本の繊維から20本の繊維を測定します。以前に測定された繊維の位置は保持されます。 オプション:化合物を追加すると、この時点で繊維を再測定できます。 実験が終了したら、下部ツールバーの 停止 ボタンを押してセルファインダーウィンドウを閉じます。ファイルを保存し、新しいファイルを開始します。 データを分析するには、プログラム「サイトソルバーデスクトップ」を開きます。 インポートをクリックし、分析するファイルを選択します。 プログラムが分析を終了したら、青、赤、灰色のピークを探します。青いピークは、プログラムによって受け入れられるトランジェントです。赤いピークはプログラムによって拒否されたトランジェントであり、灰色のピークはユーザーによって拒否されたトランジェントです。注:不合格基準は解析ソフトウェアで調整できます。一般に、値は最大導関数限界を超えると棄却され、過渡現象はカーブフィットR2 値<0.95に基づいて棄却されます。 エクスポートをクリックします。次のボックスにチェックを入れます:平均化された過渡データとExcelへのエクスポート。 終了したら、すべてのマシンの電源を切ります。培養プレートを取り出し、廃棄する。ペーサー電極を脱イオン水と70%エタノールで洗浄します。