광학 기반 시스템을 사용한 하이드로겔 내장 온전한 마우스 근육 섬유의 고처리량 수축 측정
Summary
골격근 기능은 전통적으로 힘들고 처리량이 적은 접근법을 사용하여 분리된 근육 섬유의 수축성을 정량화하여 평가할 수 있습니다. 여기에서는 하이드로겔에 내장된 근육 섬유의 수축성을 정량화하기 위한 광학 기반의 고처리량 방법을 설명합니다. 이 접근법은 약물 스크리닝 및 치료제 개발에 적용됩니다.
Abstract
체외 세포 배양은 세포 과정을 평가하고 치료 전략을 테스트하는 강력한 도구입니다. 골격근의 경우 가장 일반적인 접근 방식은 근형성 전구 세포를 미성숙 근관으로 분화하거나 분리된 개별 근섬유의 단기 생체 외 배양을 포함합니다. in vitro에 비해 생체 외 배양의 주요 이점은 복잡한 세포 구조와 수축 특성을 유지하는 것입니다. 여기에서 우리는 생쥐에서 온전한 굴근 손가락 브레비스 근육 섬유를 분리하고 후속 생체 외 배양을 위한 실험 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에서 근육 섬유는 섬유를 고정하고 수축 기능을 유지하기 위해 피브린 기반 및 기저막 매트릭스 하이드로겔에 내장되어 있습니다. 그런 다음 광학 기반의 고처리량 수축성 시스템을 사용하여 근섬유 수축 기능을 평가하는 방법을 설명합니다. 내장된 근육 섬유는 수축을 유도하기 위해 전기적으로 자극되며, 그 후 육종 단축 및 수축 속도와 같은 기능적 특성은 광학 기반 정량화를 사용하여 평가됩니다. 이 시스템과 근육 섬유 배양을 결합하면 수축 기능에 대한 약리학적 제제의 효과에 대한 고처리량 테스트와 유전적 근육 장애에 대한 생체 외 연구가 가능합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 생세포 현미경을 사용하여 근섬유의 동적 세포 과정을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.
Introduction
체외 세포 배양 기술의 발전은 잘 통제된 조건에서 포유류 조직을 사용하면서 조직 재생 능력, 병태생리학적 세포 메커니즘 및 후속 치료 전략을 연구할 수 있는 새로운 가능성을 열었습니다 1,2,3. 체외 배양 시스템의 사용은 근육 연구 분야 4,5 내에서 잘 확립되어 있습니다. 일반적으로, 시험관내 분화된 미성숙 근관은 근형성 전구세포로부터 사용된다 2,6,7,8. 보다 성숙한 근섬유를 생성하기 위한 분화 프로토콜이 진전되었지만9, 이들의 미성숙은 여전히 연구 결과의 번역을 생체 내 설정1,10으로 제한한다. 근육 생물학 분야의 한 가지 핵심 쟁점은 체외 분화된 근관이 천연 근육 조직에서 관찰되는 복잡한 세포 내 구조, 세포 신호 전달 과정 및 세포외 상호작용을 완전히 요약할 수 없다는 것이며, 중요하게는 근육 섬유에 의해 생성된 수축력을 요약할 수 없다는 것입니다 1,2,10,11,12 . 또한, 분화 과정 동안 근관의 조정되지 않은 수축은 종종 배양 접시에서 자발적으로 분리되는 결과를 초래하여 시험관 내 분화된 근관의 수축 평가를 어렵게 만들고 정성적 또는 반정량적 평가로 제한합니다 8,11,12,13. 이러한 한계로 인해 동물을 대상으로 한 정기적인 생체 내 실험이 필요한 경우가 많으며, 특히 근육 수축성이 주요 실험 결과인 경우 더욱 그렇다1.
시험관 내 분화된 근관 배양에 대한 대안은 분리된 성숙 근섬유의 생체 외 배양이다 1,14. 생체 외 배양 동안, 발달적으로 성숙한 근육 조직을 체외로 절제하고, 실험실 조건에서 배양을 위한 단세포 분리를 실시한다 1,14. 분리된 성숙 근육 섬유는 천연 조직 내에서 관찰되는 복잡한 세포 구조를 유지하며(14,15), 이 방법은 잘 정의되고 제어 가능한 배양 환경에서 유전자 조작 및 약물 스크리닝과 같은 직접적인 개입의 가능성을 열어줍니다. 골격근 섬유 분리 및 생체 외 배양에 관한 첫 번째 보고서 중 하나는 1930년대로 거슬러 올라갑니다. 그러나, 이 프로토콜로부터 생존 가능한 섬유의 수율은 낮았다16. 분리 절차 및 배양 조건의 지속적인 최적화로 생존 가능하고 기능적인 근육 섬유의 양이 크게 개선되었습니다 14,15,17,18,19. 배양 조건에서의 이러한 개선 중 하나는 배양 접시에 단리된 근육 섬유의 부착을 촉진하기 위해 세포외 기질 단백질로 배양 접시를 코팅하는 것을 포함한다(15,18,20). 일반적으로 라미닌 코팅이 사용되는데, 라미닌은 근육의 세포 외 기질 내에서 가장 풍부한 요소 중 하나이기 때문입니다20,21. 배양 접시의 코팅과 결합된 분리 절차의 최적화는 근육 연구 분야가 단기간 동안 배양에서 손상되지 않은 세포 구조와 수축 기능을 가진 분리된 생존 가능한 근육 섬유를 유지할 수 있게 해주었다 1,15,18,22.
힘 및 수축 능력을 측정하기 위해 근육 필드 내에서 사용되는 가장 통상적인 접근법은 길이 드라이버 모터와 힘 트랜스듀서(23, 24) 사이에 개별 근육 섬유를 장착하는 것이다. 일반적으로, 이러한 모터 구동 설정에 사용되는 근섬유는 급속 냉동 또는 신선한 조직에서 해부된 후 투과화 또는 “스키닝”이 수행되며, 이는 외부 칼슘 활성화를 허용하며, 여기서 다양한 칼슘 농도가 근육 섬유 수축을 유도하는 데 사용된다24. 이 방법은 근섬유 수축성 측정의 황금 표준이지만, 한 번에 하나의 근섬유만 측정할 수 있기 때문에 이 기법은 힘들고 시간이 많이 소요된다25. 또한, 근섬유의 분리 및 스키닝 절차는 흥분-수축 결합(즉, 칼슘 방출 및 이후 근질 세망으로의 재흡수)과 관련된 다양한 구조를 방해하여 이완 동역학 및 이 과정에 영향을 미칠 수 있는 질병에 대한 연구를 허용하지 않습니다26,27. 피부 섬유 제제에 대한 대안은 기계적 해부를 사용하여 온전한 근육 섬유를 분리하는 것이며, 여기서 수축력은 전기적 활성화에 대한 반응으로 측정될 수 있다28; 그러나 이 접근 방식은 기술적으로 까다롭고 시간이 많이 소요되므로 처리량이 낮은 측정이 발생합니다. 마지막으로, 피부가 벗겨진 제제와 온전한 제제 모두에서 근육 세포는 수축 측정 24 동안 세포외 환경에서 완전히 제거되어 근육 섬유 수축에 대한 세포외 기질 구성/강성의 영향에 대한 조사가 불가능하게 된다24. 그 결과, 분리된 온전한 근섬유의 근섬유 수축성 측정을 고처리량 방식으로 가능하게 하는 동시에 근섬유와 세포외 기질 사이의 연결을 재현할 수 있는 대체 방법의 개발이 필요합니다.
최근에는 고처리량 근섬유 수축성 측정을 위한 새로운 광학 기반 접근법이 개발되었습니다29. 이 광학 기반 시스템은 고속 이미징을 사용하여 수축 중 육종 길이를 평가하기 위해 근관의 주기성을 측정합니다. 이 시스템 내에서, 광학계가 이동하는 동안 세포는 배양 접시 내에 머물러 있어, 다수의 세포(29)의 측정 사이에 필요한 시간을 최소화한다. 이 고처리량 광학 기반 접근 방식을 사용하는 주요 이점은 기본 조직과 유사한 배양 조건을 개발할 수 있다는 것입니다. 천연 생체 내 조건을 모방하는 데 사용되는 접근법은 하이드로겔30에 세포를 매립하는 것입니다. 전형적으로, 하이드로겔은 그 부피 및 형상을 유지할 수 있는 점탄성 물질이며, 하이드로겔은 고체 및 액체 물질 모두의 성질을 갖는다31. 고체 부분은 서로 가교 결합 된 폴리머 사슬로 구성되어 그물30,31과 유사한 구조를 만듭니다. 히드로겔의 재료 특성은 근육(30, 31)의 매트릭스 침착을 모방하도록 조정될 수 있다. 따라서 고처리량 광학 기반 시스템과 하이드로겔에 내장된 세포의 조합은 세포외 기질 구성 및 기계적 특성이 근섬유 기능에 미치는 영향을 평가할 수 있는 새로운 가능성을 열어줍니다.
이 논문의 전반적인 목표는 1) 천연 조직 환경을 모방한 조건에서 근육 섬유의 효소 분리 및 생체 외 배양 방법론을 설명하고 2) 고처리량 접근 방식을 사용하여 근육 섬유 수축성을 평가하는 것입니다. 우리는 효소 분해를 사용하여 FDB(flexor digitorum brevis) 근육에서 많은 수의 단일 근육 섬유를 쉽게 분리하는 상세한 방법론을 설명합니다. 또한, 근육의 본래 환경을 모방하고 근섬유 생존력과 수축력을 향상시키기 위해 분리된 근섬유를 피브린계 하이드로겔에 매립하는 기술을 기술한다. 그런 다음 최근에 개발된 이 시스템을 사용하여 시험관 내에서 살아있는 근육 섬유 수축을 측정하는 고처리량 방법을 간략하게 설명합니다. 이 임베딩 절차의 또 다른 이점은 수축 동안 섬유를 고정시키는 것이며, 이는 이러한 측정의 신호 대 잡음비를 향상시킬 수 있습니다. 이 겔 포매 방법은 단일 폴리머 및 복합 겔 캡슐화 절차 모두에 적용할 수 있어 근육 섬유 수축성에 대한 세포외 기질 조성의 효과 평가를 용이하게 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 3D 배양 형식으로 FDB 근섬유의 효소 분리 및 배양을 수행한 후 광학 기반 수축 측정 시스템을 사용하여 수축 측정을 수행하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 1) 단일 근육에서 많은 온전한 근육 섬유를 간단하고 시기 적절하게 분리하는 것을 포함하여 여러 가지 장점이 있습니다. 2) 조정가능한 하이드로겔 매트릭스에 근섬유를 포매하는 단계; 3) 광학 기반 시스템을 사용한 고처리량 수축성 측정의 성능; 4) 개입 후 동일한 근육 섬유를 반복적으로 측정하는 능력. 단일 살아있는 근육 섬유의 분리는 수축 기능을 유지하는 성숙한 근육 세포를 제공합니다. 마우스 FDB에서 얻은 근섬유는 상대적으로 작기 때문에 분리 중에 쉽게 조작할 수 있고 직선 모양을 유지하여 다운스트림 수축 측정이 가능합니다. 이 시스템은 주로 심근 세포 수축을 연구하기 위해 개발되었지만, 골격근 섬유는 쉽게 구별 할 수있는 육근 패턴을 가진 동일한 수축 기계를 포함하므로이 시스템을 사용하여 측정 할 수도 있습니다29. 단일 세포 수축 측정과 생체 외 근육 섬유 배양의 결합은 전기적 활성화에 대한 반응으로 성숙한 근육 섬유 건강 및 기능을 평가하는 강력한 도구입니다.
해리된 근육 섬유 사용의 한계는 섬유에 가해지는 외력(즉, 수동적 스트레치)이 부족하여 생체 내에서 발견되는 것보다 휴식 근관 길이가 더 짧다는 것입니다. 2.4-2.5 μm의 육종 길이는 최적의 힘 생산을 보장하지만, 휴식 근관 길이는 크게 다를 수 있습니다33. FDB의 생체 내 휴식 육종 길이는 아직 설명되지 않았지만, 우리 자신의 미공개 데이터는 평균 길이가 2.2μm임을 시사합니다. 현재 결과는 배양 24시간 후 로드되지 않은 FDB 섬유에서 ~1.95μm의 평균 휴지기 육종 길이를 보여줍니다(그림 3). 이 낮은 휴식 sarcomere 길이는 더 낮은 힘 생산을 초래하지만, ~ 1.95 μm의 길이는 여전히 최대 힘34의 >90 %를 생성해야합니다. 따라서 이러한 육종 길이는 서로 다른 유전 모델 간의 또는 약물 치료 후 섬유 기능의 차이를 결정하기에 충분해야 합니다. 또한, 하이드로겔에 섬유를 매립하면 자유 부동 2D 배양 섬유에 비해 접착력에 대한 많은 추가 지점을 제공하여 시간이 지남에 따라 추가 육종 단축을 제한할 수 있습니다.
이 근섬유 분리 프로토콜의 한 가지 장점은 장신근(EDL)과 같은 다른 근육과 비교할 때 상대적으로 작은 근섬유로 구성된 쉽게 해부되는 속근근을 사용한다는 것입니다. 크기가 작을수록 근육 분리가 분쇄 기반 분리에 더 적합하므로 근육 섬유에 피펫 또는 엉킴으로 인한 손상 가능성이 줄어듭니다. FDB 근육의 세포외 기질은 콜라겐 분해 효소로 쉽게 분해 될 수 있으므로 단기간에 수백 개의 근육 섬유를 분리 할 수 있습니다. 그러나 과소화는 근육 섬유에 손상을 줄 수 있습니다. 근육 섬유의 과소화는 근육을 분쇄할 때 근육이 거의 즉시 떨어져 나갈 때 또는 세포 파종 절차 중에 세포 부피의 많은 부분이 과수축될 때 인식할 수 있습니다. 근육의 과소화를 방지하려면 각 콜라게나제 배치에 대해 소화 시간을 최적화해야 합니다. 이를 테스트하기 위해 두 개의 FDB 근육을 병행하여 소화해야 하며 그 사이에 5분의 시차를 두고 소화해야 합니다. 생존 가능한 근육 섬유의 수율이 가장 높은 소화 시간을 선택해야합니다. 그런 다음 이 최적화를 두 번째로 수행해야 하며, 다시 분해 시간에 5분의 분리를 수행해야 합니다. 가장 높은 생존 가능한 근육 섬유를 생성하는 소화 시간은 현재 콜라게나제 배치에 대한 최적의 소화 시간으로 사용되어야 합니다. 콜라게나제의 배치 간 변동성을 제한하는 또 다른 방법은 원액의 밀리리터당 활성 단위를 직접 계산한 다음 후속 콜라게나제 배치를 동일한 양으로 재구성하는 것입니다. 마지막으로, 소화 시간은 예를 들어 증가된 세포외 기질 침착을 나타내는 노화되거나 병든 동물을 연구하는 경우 다양한 마우스 균주에 걸쳐 최적화되어야 할 수 있습니다35,36.
생존 가능한 분리된 근섬유를 피펫팅할 수 있는 가능성은 다양한 배양 조건에서 FDB 근섬유를 배양할 수 있는 가능성을 열어줍니다. 이러한 옵션 중 하나는 천연 조직 배양 환경을 모방하기 위해 하이드로겔에서 이러한 섬유를 배양하는 것입니다. 이 임베딩 프로토콜은 수축 측정 중에 섬유가 제자리에 유지되도록 보장하고 겔이 굳기 전에 섬유가 플레이트 바닥에 가라앉을 수 있도록 최적화되었습니다. 그러나 이 프로토콜은 트롬빈과 피브리노겐 스톡의 차이를 수용하기 위해 조정해야 할 수도 있습니다. 트롬빈 활성이 너무 높으면 젤이 조기에 굳어지고 섬유가 현미경의 초점면 외부의 더 높은 위치에 부유 상태를 유지할 수 있습니다. 이 경우 트롬빈:피브리노겐 비율을 조정해야 합니다. 이것은 점점 더 낮은 트롬빈 농도로 섬유를 도금하고 중합에 걸리는 시간을 기록하여 테스트할 수 있습니다. 일반적으로 이 작업은 30분보다 빠르지 않아야 합니다. 그러나, 너무 낮은 트롬빈 농도를 갖는 것은 또한 중합 과정을 손상시킬 수 있다. 섬유가 올바른 초점면에 있는지 확인하는 또 다른 방법은 먼저 2D 프로토콜을 사용하여 시드한 다음 배양 플레이트에 부착된 후 섬유 위에 하이드로겔 층을 추가하는 것입니다. 그러나 섬유에서 매체를 제거하면 건조에 민감하기 때문에 과수축을 유발할 수 있음을 알아야 합니다. 하이드로겔이 배양 접시에 완전히 부착되는지 여부도 불분명하며 더 쉽게 느슨해질 수 있습니다. 따라서 이 매립 절차는 섬유를 생존 가능하게 유지하고 수축 측정을 위해 제자리에 유지하는 데 바람직합니다.
이 프로토콜의 사용은 생체 외에서 성숙한 근육 섬유의 수축 역학을 연구할 수 있게 하며 건강한 마우스와 근육 질환에 대한 유전적 돌연변이를 가진 마우스 모두에 적용할 수 있습니다. 마찬가지로, 배양 조건이나 화합물 첨가가 근육 섬유 기능에 어떤 영향을 미치는지 테스트할 수 있습니다. 광학 기반 시스템을 사용하여 얻은 수축성 데이터는 살아있는 단일 근육 섬유의 수축 능력을 나타내며 이 능력의 변화는 섬유 건강과 상관관계가 있을 수 있습니다. 그러나 이러한 데이터만으로는 이러한 변화가 근육 수축의 액틴-미오신 교차 가교 또는 칼슘 방출 단계에서 발생하는지 여부를 결정하기에 충분하지 않습니다. 이 프로토콜에서 칼슘 신호 전달을 측정하는 방법을 설명하지는 않지만, 이 설정은 수축하는 근육 세포에서 Fura 기반 칼슘 과도 현상을 측정할 수도 있습니다29. 이 시스템의 단점은 FDB 근육이 속근 IIa형/IIx형 근섬유만을 함유하고 있고, 이 크기의 저속 경련 I형 섬유를 함유하는 근육은 아직 설명되지 않았다는 것이다 37. 이것은 이 방법을 사용하여 섬유 유형별 기능을 연구하는 능력을 제거합니다. 여기서 제안하는 프로토콜은 섬유 유형 차이를 연구하기 위해 EDL 또는 가자미근과 같은 다른 근육에 잠재적으로 적용될 수 있습니다. 크기가 더 크기 때문에 이 프로토콜은 이러한 근육에 대해 추가로 최적화되어야 합니다. 더 긴 섬유는 중력 침강 단계에서 엉키는 경향이 있으며 피펫팅으로 조작하면 파열되어 수율이 낮아집니다. 따라서 피펫팅과 호환되지 않기 때문에 더 긴 섬유는 겔 임베딩 기술과도 호환성이 떨어집니다. 이러한 섬유의 측정은 여전히 2D 배양 형식으로 수행할 수 있지만 섬유는 크기 때문에 수축 중에 더 많이 움직일 수 있으므로 신호 대 잡음비에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 시스템의 또 다른 한계는 다른 온전한 근섬유 제제(28)를 사용하여 얻을 수 있는 힘 측정과 같은 수축성 측정과 함께 힘 측정을 수행할 수 없다는 것이다. 그러나 이러한 제한은 근섬유에 의해 생성되는 힘을 추정함으로써 우회할 수 있습니다. 근섬유의 발생력은 수축 및 이완 상태 동안의 근섬유 형태와 매트릭스의 영률(Young’s modulus)이 알려져 있는 경우 추정할 수 있다25. 그럼에도 불구하고 이 광학 기반 시스템은 근육 수축 기능을 연구하기 위한 사용하기 쉬운 고처리량 접근 방식을 제공하고 유전적 근육 질환 및 치료 개입을 연구하기 위한 다양한 새로운 가능성을 열어줍니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이 프로토콜을 개발하는 데 도움을 준 기술 전문 지식을 제공한 Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes 및 Emmy Manders에게 감사를 표합니다. 이 연구는 근이영양증 협회 (T.J.K에 MDA603238 개발 상), 네덜란드 심혈관 연합 (TJK에 재능 보조금) 및 국립 보건 및 의료 연구위원회 (NHMRC, 호주; 친교 APP1121651 M.Y).
Materials
| Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
| Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
| Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Equipment | |||
| 24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
| MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
| MyoPacer | IonOptix | N/a | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
| Vannas Spring Scissor – 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Software | |||
| CytoSolver | IonOptix | N/a | |
| IonWizard | IonOptix | N/a |
References
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