Mesures contractiles à haut débit de fibres musculaires de souris intactes incorporées dans un hydrogel à l’aide d’un système optique
Summary
La fonction musculaire squelettique peut être évaluée en quantifiant la contractilité de fibres musculaires isolées, traditionnellement en utilisant des approches laborieuses à faible débit. Ici, nous décrivons une méthode optique à haut débit pour quantifier la contractilité des fibres musculaires incorporées dans l’hydrogel. Cette approche a des applications pour le dépistage de médicaments et le développement thérapeutique.
Abstract
La culture cellulaire in vitro est un outil puissant pour évaluer les processus cellulaires et tester les stratégies thérapeutiques. Pour le muscle squelettique, les approches les plus courantes consistent soit à différencier les cellules progénitrices myogéniques en myotubes immatures, soit à cultiver ex vivo à court terme des fibres musculaires individuelles isolées. L’un des principaux avantages de la culture ex vivo par rapport à la culture in vitro est la conservation de l’architecture cellulaire complexe et des caractéristiques contractiles. Ici, nous détaillons un protocole expérimental pour l’isolement des fibres musculaires intactes du fléchisseur digitorum brevis de souris et leur culture ex vivo ultérieure. Dans ce protocole, les fibres musculaires sont intégrées dans un hydrogel à base de fibrine et à matrice membranaire basale pour immobiliser les fibres et maintenir leur fonction contractile. Nous décrivons ensuite des méthodes pour évaluer la fonction contractile des fibres musculaires à l’aide d’un système de contractilité à haut débit basé sur l’optique. Les fibres musculaires intégrées sont stimulées électriquement pour induire des contractions, après quoi leurs propriétés fonctionnelles, telles que le raccourcissement du sarcomère et la vitesse contractile, sont évaluées à l’aide d’une quantification optique. Le couplage de la culture de fibres musculaires avec ce système permet des tests à haut débit des effets des agents pharmacologiques sur la fonction contractile et des études ex vivo des troubles musculaires génétiques. Enfin, ce protocole peut également être adapté pour étudier les processus cellulaires dynamiques dans les fibres musculaires à l’aide de la microscopie à cellules vivantes.
Introduction
Les progrès des techniques de culture cellulaire in vitro ont ouvert de nouvelles possibilités pour étudier les capacités de régénération des tissus, les mécanismes cellulaires physiopathologiques et les stratégies thérapeutiques subséquentes, tout en utilisant des tissus de mammifères dans des conditions bien contrôlées 1,2,3. L’utilisation de systèmes de culture in vitro est bien établie dans le domaine de la recherche musculaire 4,5. En général, on utilise in vitro des myotubes immatures différenciés provenant de cellules progénitrices myogéniques 2,6,7,8. Bien que des progrès aient été réalisés dans le protocole de différenciation pour générer des fibres musculaires plus matures9, leur immaturité limite encore la traduction des résultats à un cadre in vivo 1,10. Un problème central dans le domaine de la biologie musculaire est l’incapacité des myotubes différenciés in vitro à incarner pleinement les structures intracellulaires complexes, les processus de signalisation cellulaire et les interactions extracellulaires observés dans le tissu musculaire natif et, surtout, à récapituler les forces contractiles produites par les fibres musculaires 1,2,10,11,12 . De plus, la contraction non coordonnée des myotubes au cours du processus de différenciation entraîne souvent un détachement spontané des boîtes de culture, ce qui rend l’évaluation contractile des myotubes différenciés in vitro difficile et limitée à une évaluation qualitative ou semi-quantitative 8,11,12,13. Ces limitations nécessitent souvent des expériences in vivo régulières sur des animaux, en particulier si la contractilité musculaire est un résultat expérimental primaire1.
Une alternative à la culture in vitro-différencié des myotubes est la culture ex vivo de fibres musculaires matures isolées 1,14. Au cours de la culture ex vivo, le tissu musculaire mature sur le plan du développement est excisé hors du corps, suivi d’un isolement unicellulaire pour la culture dans des conditions de laboratoire 1,14. Les fibres musculaires matures isolées maintiennent leurs structures cellulaires complexes observées dans le tissu natif14,15, et cette méthode ouvre la possibilité d’interventions directes, telles que la manipulation génétique et le dépistage de médicaments, dans un environnement de culture bien défini et contrôlable. L’un des premiers rapports concernant l’isolement des fibres musculaires squelettiques et la culture ex vivo remonte aux années 1930; Cependant, le rendement en fibres viables de ce protocole était faible16. Avec l’optimisation continue de la procédure d’isolement et des conditions de culture, une amélioration significative de la quantité de fibres musculaires viables et fonctionnelles est maintenant possible 14,15,17,18,19. Une telle amélioration des conditions de culture consiste à enrober les boîtes de culture avec des protéines de matrice extracellulaire pour favoriser l’adhérence des fibres musculaires isolées sur la boîte de culture15,18,20. Habituellement, un revêtement de laminine est utilisé, car la laminine est l’un des éléments les plus abondants dans la matrice extracellulaire des muscles20,21. L’optimisation de la procédure d’isolement combinée au revêtement des boîtes de culture a permis au domaine de la recherche musculaire de conserver des fibres musculaires viables isolées avec une architecture cellulaire intacte et une fonctionnalité contractile en culture pendant de courtes périodes de temps 1,15,18,22.
L’approche la plus conventionnelle utilisée dans le champ musculaire pour mesurer la force et les capacités contractiles consiste à monter des fibres musculaires individuelles entre un moteur conducteur de longueur et un transducteurde force 23,24. En général, les fibres musculaires utilisées pour ces configurations motorisées sont disséquées à partir de tissus surgelés ou frais, suivis d’une perméabilisation ou d’un « écorchage », qui permet l’activation externe du calcium, où des concentrations variables de calcium sont utilisées pour induire la contraction des fibres musculaires24. Bien que cette méthode soit l’étalon-or pour les mesures contractiles des fibres musculaires, une seule fibre musculaire peut être mesurée à la fois, ce qui fait de cette technique une procédure laborieuse et longue25. De plus, la procédure d’isolement et de dépouillement des fibres musculaires perturbe les diverses structures impliquées dans le couplage excitation-contraction (c.-à-d. libération de calcium et recapture ultérieure dans le réticulum sarcoplasmique), ne permettant ainsi pas l’étude de la cinétique de relaxation et de toute maladie qui pourrait affecter ce processus26,27. Une alternative à la préparation de fibres écorchées consiste à utiliser la dissection mécanique pour isoler les fibres musculaires intactes, où les forces contractiles peuvent être mesurées en réponse à l’activation électrique28; Cependant, cette approche est techniquement difficile et prend beaucoup de temps, ce qui entraîne des mesures à faible débit. Enfin, dans les préparations pelées et intactes, les cellules musculaires sont complètement retirées de l’environnement extracellulaire lors des mesures contractiles 24, ce qui rend impossible l’étude de l’effet de la composition/rigidité de la matrice extracellulaire sur la contraction des fibres musculaires24. En conséquence, le développement de méthodes alternatives est nécessaire pour permettre des mesures de contractilité des fibres musculaires isolées intactes de manière à haut débit tout en recréant la connexion entre les fibres musculaires et la matrice extracellulaire.
Récemment, une nouvelle approche basée sur l’optique pour les mesures de contractilité des fibres musculaires à haut débit a été développée29. Ce système basé sur l’optique mesure la périodicité des sarcomères pour évaluer la longueur du sarcomère pendant la contraction en utilisant l’imagerie à grande vitesse. Dans ce système, les cellules restent en place dans la boîte de culture pendant que l’optique est déplacée, minimisant ainsi le temps nécessaire entre les mesures de plusieurs cellules29. Un avantage majeur de l’utilisation de cette approche à haut débit basée sur l’optique est qu’elle permet de développer des conditions de culture similaires à celles du tissu natif. Une approche utilisée pour imiter les conditions in vivo natives consiste à incorporer des cellules dans des hydrogels30. Typiquement, un hydrogel est un matériau viscoélastique capable de maintenir son volume et sa forme, et les hydrogels ont les propriétés des matériaux solides et liquides31. La partie solide est constituée de chaînes de polymères réticulées les unes aux autres, créant une structure qui ressemble à un filet30,31. Les propriétés matérielles des hydrogels peuvent être réglées pour imiter le dépôt matriciel des muscles30,31. Ainsi, la combinaison d’un système optique à haut débit avec des cellules intégrées dans des hydrogels ouvre de nouvelles possibilités pour évaluer les effets de la composition de la matrice extracellulaire et des propriétés mécaniques sur la fonctionnalité des fibres musculaires.
L’objectif global de cet article est de 1) décrire la méthodologie pour l’isolement enzymatique et la culture ex vivo de fibres musculaires dans des conditions imitant l’environnement tissulaire natif et 2) évaluer la contractilité des fibres musculaires en utilisant une approche à haut débit. Nous décrivons une méthodologie détaillée pour isoler facilement un grand nombre de fibres musculaires simples du muscle fléchisseur digitorum brevis (FDB) en utilisant la digestion enzymatique. En outre, nous décrivons une technique pour intégrer les fibres musculaires isolées dans un hydrogel à base de fibrine dans le but d’imiter l’environnement natif des muscles et d’améliorer la viabilité et la contractilité des fibres musculaires. Nous décrivons ensuite une méthode à haut débit de mesure in vitro des contractions de fibres musculaires vivantes à l’aide de ce système récemment développé. Un avantage supplémentaire de cette procédure d’intégration est l’immobilisation des fibres pendant la contraction, ce qui peut améliorer le rapport signal sur bruit de ces mesures. Cette méthode d’incorporation de gel est applicable aux procédures d’encapsulation de gel monopolymère et composite, facilitant l’évaluation des effets de la composition de la matrice extracellulaire sur la contractilité des fibres musculaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous détaillons un protocole pour effectuer l’isolement enzymatique et la culture des fibres musculaires FDB dans un format de culture 3D, suivi de mesures contractiles à l’aide d’un système de mesure contractile basé sur l’optique. Ce protocole présente un certain nombre d’avantages, notamment le 1) isolement direct et opportun de nombreuses fibres musculaires intactes à partir d’un seul muscle; 2) l’incorporation des fibres musculaires dans une matrice d’hydrogel accordable; 3) la réalisation de mesures de contractilité à haut débit à l’aide du système optique; et 4) la capacité d’effectuer des mesures répétées des mêmes fibres musculaires après une intervention. L’isolement de fibres musculaires vivantes uniques fournit des cellules musculaires matures qui conservent leur fonction contractile. Comme les fibres musculaires obtenues à partir de la souris FDB sont relativement petites, elles sont facilement manipulées pendant l’isolement et conservent leur forme droite, ce qui permet des mesures contractiles en aval. Bien que le système ait été principalement développé pour étudier la contraction des cardiomyocytes, les fibres musculaires squelettiques contiennent la même machinerie contractile avec des motifs de sarcomères facilement distinguables et, par conséquent, peuvent également être mesurées à l’aide de ce système29. Le couplage de mesures contractiles unicellulaires avec une culture de fibres musculaires ex vivo vivantes est un outil puissant pour évaluer la santé et la fonction des fibres musculaires matures en réponse à l’activation électrique.
Une limitation de l’utilisation de fibres musculaires dissociées est l’absence de forces externes (c.-à-d. étirement passif) appliquées aux fibres, ce qui entraîne des longueurs de sarcomère au repos inférieures à celles trouvées in vivo. Bien qu’une longueur de sarcomère de 2,4 à 2,5 μm assure une production de force optimale, la longueur du sarcomère au repos peut varier considérablement33. Bien que la longueur du sarcomère au repos in vivo du FDB n’ait pas encore été décrite, nos propres données non publiées suggèrent une longueur moyenne de 2,2 μm. Les résultats actuels montrent une longueur moyenne de sarcomère au repos de ~1,95 μm dans les fibres FDB déchargées après 24 heures en culture (Figure 3). Bien que cette longueur de sarcomère au repos inférieure entraînerait une production de force plus faible, une longueur de ~1,95 μm devrait toujours produire >90% de la force maximale34. En tant que telles, ces longueurs de sarcomère devraient être suffisantes pour déterminer les différences de fonction des fibres entre différents modèles génétiques ou après des traitements médicamenteux. De plus, l’incorporation de fibres dans un hydrogel fournit de nombreux points d’adhérence supplémentaires par rapport aux fibres cultivées 2D flottantes librement, ce qui limiterait le raccourcissement supplémentaire du sarcomère au fil du temps.
L’un des avantages de ce protocole d’isolation des fibres musculaires est l’utilisation d’un muscle à contraction rapide facilement disséqué composé de fibres musculaires relativement petites par rapport à d’autres muscles, tels que l’extenseur digitorum longus (EDL). Leur taille plus petite rend l’isolement musculaire plus approprié pour la séparation basée sur la trituration, réduisant ainsi le risque de dommages induits par la pipette ou l’enchevêtrement des fibres musculaires. La matrice extracellulaire des muscles FDB peut être facilement digérée enzymatiquement avec de la collagénase, ce qui permet d’isoler des centaines de fibres musculaires en peu de temps. Cependant, une surdigestion peut endommager les fibres musculaires. La surdigestion des fibres musculaires peut être reconnue lorsque le muscle se désagrège presque instantanément lors de la trituration du muscle ou lorsqu’une grande partie du volume cellulaire est hypercontractée pendant la procédure d’ensemencement cellulaire. Pour éviter la surdigestion du muscle, le temps de digestion doit être optimisé pour chaque lot de collagénase. Pour tester cela, deux muscles FDB doivent être digérés en parallèle avec un temps de digestion décalé de 5 minutes entre eux. Le temps de digestion avec le rendement le plus élevé en fibres musculaires viables doit être choisi. Cette optimisation doit ensuite être effectuée une seconde fois, toujours avec 5 min de séparation en temps de digestion. Le temps de digestion produisant les fibres musculaires les plus viables doit être utilisé comme temps de digestion optimal pour le lot actuel de collagénase. Une autre façon de limiter la variabilité de la collagénase d’un lot à l’autre serait de calculer directement les unités d’activité par millilitre de solution mère, puis de reconstituer les lots de collagénase suivants à la même quantité. Enfin, les temps de digestion peuvent devoir être optimisés pour différentes souches de souris, par exemple, si vous étudiez des animaux âgés ou malades qui présentent une augmentation du dépôt de matrice extracellulaire35,36.
La possibilité de pipeter des fibres musculaires isolées viables ouvre des possibilités de culture de fibres musculaires FDB dans diverses conditions de culture. L’une de ces options est la culture de ces fibres dans des hydrogels pour imiter l’environnement de culture tissulaire indigène. Ce protocole d’encastrement garantit que les fibres restent en place pendant les mesures contractiles et a été optimisé pour permettre aux fibres de se déposer au fond de la plaque avant la prise du gel. Cependant, ce protocole peut devoir être ajusté pour tenir compte des différences dans les stocks de thrombine et de fibrinogène. Si l’activité de la thrombine est trop élevée, le gel prendra prématurément et les fibres peuvent rester suspendues à des endroits plus élevés en dehors du plan focal du microscope. Si cela se produit, le rapport thrombine:fibrinogène doit être ajusté. Cela peut être testé en plaquant des fibres à des concentrations de thrombine de plus en plus faibles et en prenant note de la durée de la polymérisation. En règle générale, cela ne devrait pas se produire plus vite que 30 minutes. Cependant, avoir une concentration de thrombine trop faible peut également nuire au processus de polymérisation. Une autre méthode pour s’assurer que les fibres sont dans le bon plan focal consiste à les ensemencer d’abord à l’aide d’un protocole 2D, puis à ajouter une couche d’hydrogel sur les fibres après qu’elles aient adhéré à la plaque de culture. Cependant, il faut savoir que l’élimination du milieu des fibres peut induire une hypercontraction, car elles sont sensibles au dessèchement. On ne sait pas non plus si l’hydrogel se fixera complètement à la plaque de culture, et il pourrait se détacher plus facilement. Par conséquent, cette procédure d’encastrement est préférable pour maintenir les fibres viables et en place pour les mesures de contraction.
L’utilisation de ce protocole permet l’étude de la dynamique contractile des fibres musculaires matures ex vivo et peut être appliquée à la fois aux souris saines et à celles porteuses de mutations génétiques pour les maladies musculaires. De même, il permet de tester comment les conditions de culture ou l’ajout de composés affectent la fonction des fibres musculaires. Les données contractiles obtenues à l’aide du système optique donnent une indication de la capacité contractile des fibres musculaires simples vivantes, et les changements dans cette capacité peuvent être corrélés à la santé des fibres. Ces données seules ne sont toutefois pas suffisantes pour déterminer si ces changements se produisent aux stades de transition croisée actine-myosine ou de libération de calcium de la contraction musculaire. Bien que nous ne décrivions pas les méthodes de mesure de la signalisation du calcium dans ce protocole, cette configuration est également capable de mesurer les transitoires de calcium à base de Fura dans les cellules musculaires contractantes29. Un inconvénient de ce système est que le muscle FDB ne contient que des fibres musculaires de type IIa/IIx à contraction rapide, et les muscles contenant des fibres de type I à contraction lente de cette taille n’ont pas encore été décrits37. Cela élimine la possibilité d’étudier le fonctionnement spécifique du type de fibre à l’aide de cette méthode. Le protocole que nous proposons ici pourrait potentiellement être adapté à d’autres muscles tels que l’EDL ou le soléaire pour étudier les différences de type de fibre. En raison de leur plus grande taille, ce protocole devrait être optimisé davantage pour ces muscles. Les fibres plus longues ont tendance à s’emmêler pendant l’étape de sédimentation par gravité et se rompront si elles sont manipulées par pipetage, ce qui entraînerait un rendement plus faible. En raison de leur incompatibilité avec le pipetage, les fibres plus longues sont donc également moins compatibles avec la technique d’enrobage de gel. Les mesures de ces fibres peuvent toujours être effectuées dans un format de culture 2D, mais les fibres peuvent se déplacer davantage pendant la contraction en raison de leur taille, affectant ainsi le rapport signal sur bruit. Une autre limitation de ce système est l’incapacité d’effectuer des mesures de force parallèlement aux mesures contractiles, telles que les mesures de force qui peuvent être obtenues en utilisant d’autres préparations de fibres musculaires intactes28. Cependant, cette limitation peut être contournée en estimant la force générée par la fibre musculaire. La force générée des fibres musculaires peut être estimée si la forme des fibres musculaires pendant les états contractés et détendus ainsi que le module de Young de la matrice sont connus25. Néanmoins, ce système optique offre une approche facile à utiliser et à haut débit pour étudier la fonction contractile musculaire et ouvre une gamme de nouvelles possibilités pour l’étude des maladies musculaires génétiques et des interventions thérapeutiques.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes et Emmy Manders pour leur expertise technique dans le développement de ce protocole. Ce travail a été soutenu par des prix de la Muscular Dystrophy Association (Development Award MDA603238 à T.J.K), de la Dutch Cardiovascular Alliance (Talent Grant to T.J.K) et du National Health and Medical Research Council (NHMRC, Australie; Fellowship APP1121651 à M.Y).
Materials
| Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
| Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
| Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Equipment | |||
| 24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
| MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
| MyoPacer | IonOptix | N/a | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
| Vannas Spring Scissor – 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Software | |||
| CytoSolver | IonOptix | N/a | |
| IonWizard | IonOptix | N/a |
References
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