Malaria överförs genom inokulering av sporozoitstadiet av Plasmodium av infekterade myggor. Transgent Plasmodium har gjort det möjligt för oss att förstå malarians biologi bättre och har bidragit direkt till utvecklingen av malariavaccin. Här beskriver vi en strömlinjeformad metodik för att generera transgena Plasmodium berghei-sporozoiter.
Malaria är en dödlig sjukdom som orsakas av parasiten Plasmodium och överförs genom bett av honmyggor . Sporozoitstadiet av Plasmodium som deponeras av myggor i huden på ryggradsdjur genomgår en fas av obligatorisk utveckling i levern innan klinisk malaria inleds. Vi vet lite om biologin bakom Plasmodiums utveckling i levern; tillgång till sporozoitstadiet och förmågan att genetiskt modifiera sådana sporozoiter är viktiga verktyg för att studera arten av Plasmodium-infektion och det resulterande immunsvaret i levern. Här presenterar vi ett omfattande protokoll för generering av transgena Plasmodium berghei-sporozoiter. Vi genmodifierar P. berghei i blodstadiet och använder denna form för att infektera Anopheles-myggor när de tar en blodmåltid. Efter att de transgena parasiterna har utvecklats i myggorna isolerar vi parasitens sporozoitstadium från myggornas spottkörtlar för in vivo och in vitro-experiment . Vi demonstrerar protokollets giltighet genom att generera sporozoiter av en ny stam av P. berghei som uttrycker det gröna fluorescerande proteinet (GFP) subenhet 11 (GFP11), och visar hur det kan användas för att undersöka biologin bakom levermalaria.
Trots framsteg inom läkemedelsutveckling och forskning om förebyggande och behandling av malaria är den globala sjukdomsbördan av malaria fortfarande hög. Över en halv miljon människor dör av malaria varje år, och den högsta dödligheten bland barn som lever i malariaendemiska regioner,såsom Afrika söder om Sahara1. Malaria orsakas av parasiten Plasmodium, som överförs till människor genom bett av honmyggor av hona som bär parasiten i sina spottkörtlar. Det infektiösa stadiet av Plasmodium – sporozoiterna – deponeras i huden hos ryggradsdjuren under en blodmåltid och färdas genom blodomloppet för att infektera leverceller, där de genomgår obligatorisk utveckling (som utgör pre-erytrocytisk malaria) innan de infekterar erytrocyterna. Infektionen i erytrocyterna initierar malarians blodstadium och är ansvarig för hela den sjuklighet och dödlighet som är förknippadmed sjukdomen.
Den obligatoriska karaktären hos den pre-erytrocytiska utvecklingen av Plasmodium har gjort det till ett attraktivt mål för profylaktiska vaccin- och läkemedelsutvecklingsinsatser4. En förutsättning för att studera biologin bakom pre-erytrocytisk malaria, samt utveckling av vacciner eller läkemedel som riktar sig mot leverstadiet, är tillgång till Plasmodium sporozoiter. Dessutom har vår förmåga att generera genetiskt modifierade Plasmodium sporozoiter varit avgörande för framgången för sådana forskningssträvanden 5,6,7,8,9. Transgena Plasmodium-linjer som uttrycker fluorescerande eller självlysande reporterproteiner har gjort det möjligt för oss att spåra deras utveckling in vivo och in vitro10,11. Genetiskt försvagade parasiter (GAPs), som genereras genom radering av flera gener i Plasmodium, är också några av de mest lovande vaccinkandidaterna12,13.
Malariamodeller från gnagare och icke-mänskliga primater har hjälpt oss att förstå mekanismerna för värd-parasitinteraktioner i mänsklig malaria på grund av likheterna i biologi och livscykel mellan Plasmodium-arter 14. Användningen av Plasmodium-arter som infekterar gnagare, men inte människor (t.ex. P. berghei) gör det möjligt att upprätthålla parasitens hela livscykel och generera infektiösa sporozoiter för att studera malaria i leverstadiet i en kontrollerad biosäkerhetsnivå 1-miljö. Det finns redan en mängd separata protokoll för generering av transgena Plasmodium-parasiter i blodstadiet15, infektion av myggor 16 och isolering av sporozoiter17. Här beskriver vi ett omfattande protokoll som kombinerar dessa metoder för att generera och isolera transgena P. berghei-sporozoiter, med hjälp av den nya transgena stammen PbGFP11 som exempel. PbGFP 11 transporterar den 11:e β-strängen av det gröna fluorescerande proteinet (GFP), GFP11, till den parasitofora vakuolen (PV) som genereras i värdhepatocyterna. PbGFP 11 används tillsammans med transgena hepatocyter (Hepa1-6-bakgrund) som uttrycker rester som utgör GFP 1-10-fragmentet (GFP 1-10) i cytoplasman (Hepa GFP 1-10-celler). PbGFP11 rapporterar PV-lys i värdhepatocyterna genom självkomplementering och reformation av funktionell GFP och den gröna fluorescenssignalen18. Värt att notera är att GFP 11 kodas som en serie av sju tandemsekvenser i PbGFP11 för att förstärka den resulterande fluorescenssignalen. Genom att färga PbGFP11-sporozoiter med det cytoplasmatiska färgämnet CellTrace Violet (CTV) kan vi spåra parasiterna. Lysen av sådana CTV-färgade intracellulära parasiter resulterar i sig i läckage av CTV in i värdcellens cytoplasma och färgning av värdcellen. Förutom att visualisera och särskilja lysen av Plasmodium PV och/eller parasiten i värdhepatocyter, kan detta system på ett tillförlitligt sätt användas för att studera de immunvägar som är ansvariga för någon av dessa processer, genom genetisk eller terapeutisk störning av de molekylära komponenterna i sådana vägar.
Vi har använt ovanstående protokoll i vårt laboratorium för att skapa flera linjer av transgena P. berghei-parasiter. Även om det är optimerat för P. berghei, har vi också framgångsrikt använt detta protokoll för att generera transgena P. yoelii sporozoiter. Efter att ha injicerat de transfekterade schizonterna i möss kan parasiter vanligtvis inte påvisas senare än 3 dpi i alla grupper, inklusive kontrollen utan plasmid. Selektionen påbörjas först när parasitemi har upptäckts…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Healths anslag AI168307 till SPK. Vi tackar UGA CTEGD Flow Cytometry Core och UGA CTEGD Microscopy Core. Vi erkänner också bidragen från Ash Pathak, Anne Elliot och personalen på UGA Sporocore för att optimera protokollet. Vi vill tacka Dr. Daichi Kamiyama för värdefulla insikter, diskussioner och de moderplasmider som innehåller GFP11 och GFP 1-10. Vi vill också tacka medlemmarna i Kurup-labbet för deras ständiga stöd, tålamod och uppmuntran.
30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
Delta Vision II – Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |