Geração de Esporozoítos Geneticamente Modificados de Plasmodium berghei

Apesar dos avanços no desenvolvimento de medicamentos e na pesquisa para prevenção e tratamento da malária, a carga global de doenças da malária permanece alta. Mais de meio milhão de pessoas morrem de malária a cada ano, com os níveis mais altos de mortalidade observados entre crianças que vivem em regiões endêmicas de malária, como a África Subsaariana¹. A malária é causada pelo parasita Plasmodium, que é transmitido aos seres humanos através da picada de fêmeas de mosquitos Anopheles portadores do parasita em suas glândulas salivares. O estágio infeccioso do Plasmodium – os esporozoítos – são depositados na pele dos hospedeiros vertebrados durante uma refeição de sangue e viajam pela corrente sanguínea para infectar as células do fígado, onde passam pelo desenvolvimento obrigatório (constituindo malária pré-eritrocitária) antes de infectar os eritrócitos. A infecção dos eritrócitos inicia o estágio sanguíneo da malária e é responsável pela totalidade da morbidade e mortalidade associadas à doença ^2,3.

A natureza obrigatória do desenvolvimento pré-eritrocitário do Plasmodium tornou-o um alvo atraente para os esforços profiláticos de desenvolvimento de vacinas e fármacos⁴. Um pré-requisito para o estudo da biologia da malária pré-eritrocitária, bem como o desenvolvimento de vacinas ou drogas direcionadas ao estágio hepático, é o acesso aos esporozoítos de Plasmodium. Além disso, nossa capacidade de gerar esporozoítos de Plasmodium geneticamente modificados tem sido fundamental para o sucesso de tais esforços de pesquisa5,6,7,8,9. Linhagens transgênicas de Plasmodium expressando proteínas repórteres fluorescentes ou luminescentes têm permitido acompanhar seu desenvolvimento in vivo e in vitro^10,11. Parasitas geneticamente atenuados (GAPs), gerados pela deleção de múltiplos genes no Plasmodium, também são alguns dos mais promissores candidatos vacinais^12,13.

Modelos de malária em roedores e primatas não humanos têm nos ajudado a entender os mecanismos das interações parasita-hospedeiro na malária humana devido às semelhanças na biologia e no ciclo de vida entre as espécies de Plasmodium ¹⁴. O uso de espécies de Plasmodium que infectam roedores, mas não humanos (por exemplo, P. berghei) permite a manutenção do ciclo de vida completo do parasita e a geração de esporozoítos infecciosos para o estudo da malária em estágio hepático em um ambiente controlado de nível 1 de biossegurança. Uma variedade de protocolos separados já existe para a geração de parasitas transgênicos do Plasmodium em estágio sanguíneo 15, infecção de mosquitos¹⁶ e isolamento de esporozoítos¹⁷. Aqui, delineamos um protocolo abrangente combinando essas metodologias para gerar e isolar esporozoítos transgênicos de P. berghei, utilizando a nova cepa transgênica PbGFP₁₁ como exemplo. A PbGFP 11 trafega a 11ª fita β da proteína fluorescente verde (GFP) superpasta, GFP₁₁, para o vacúolo parasitóforo (PV) gerado nos hepatócitos hospedeiros. A PbGFP₁₁ é usada em conjunto com hepatócitos transgênicos (Hepa1-6 background) expressando resíduos que constituem o fragmento GFP 1-10 (GFP 1-10) no citoplasma (células Hepa GFP _1-10). A PbGFP₁₁ relata lise PV nos hepatócitos hospedeiros através da autocomplementação e da reforma da GFP funcional e do sinal verde de fluorescência¹⁸. De notar, GFP 11 é codificado como uma série de sete sequências tandem em PbGFP₁₁ para aumentar o sinal de fluorescência resultante. Ao colorir esporozoítos de PbGFP₁₁ com o corante citoplasmático CellTrace Violet (CTV), podemos rastrear os parasitas. A lise desses parasitas intracelulares corados pelo CTV resulta em extravasamento de CTV para o citoplasma da célula hospedeira e coloração da célula hospedeira. Além de visualizar e distinguir a lise do Plasmodium PV e/ou do parasita em hepatócitos hospedeiros, esse sistema pode ser usado de forma confiável para estudar as vias imunes responsáveis por qualquer um desses processos, através da perturbação genética ou terapêutica dos componentes moleculares dessas vias.