Generación de esporozoítos de Plasmodium berghei modificados genéticamente
Summary
La malaria se transmite a través de la inoculación de la etapa de esporozoíto de Plasmodium por mosquitos infectados. El Plasmodium transgénico nos ha permitido comprender mejor la biología de la malaria y ha contribuido directamente a los esfuerzos de desarrollo de vacunas contra la malaria. En este trabajo se describe una metodología simplificada para generar esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei .
Abstract
La malaria es una enfermedad mortal causada por el parásito Plasmodium y se transmite a través de la picadura de mosquitos Anopheles hembra. La etapa de esporozoíto de Plasmodium depositada por los mosquitos en la piel de los huéspedes vertebrados pasa por una fase de desarrollo obligatorio en el hígado antes de iniciar la malaria clínica. Sabemos poco sobre la biología del desarrollo de Plasmodium en el hígado; El acceso a la etapa de esporozoíto y la capacidad de modificar genéticamente dichos esporozoítos son herramientas críticas para estudiar la naturaleza de la infección por Plasmodium y la respuesta inmunitaria resultante en el hígado. Aquí, presentamos un protocolo integral para la generación de esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei . Modificamos genéticamente el estadio sanguíneo de P. berghei y usamos esta forma para infectar a los mosquitos Anopheles cuando se alimentan de sangre. Después de que los parásitos transgénicos experimentan el desarrollo en los mosquitos, aislamos la etapa de esporozoíto del parásito de las glándulas salivales del mosquito para la experimentación in vivo e in vitro . Demostramos la validez del protocolo mediante la generación de esporozoítos de una nueva cepa de P. berghei que expresa la subunidad 11 de la proteína verde fluorescente (GFP) (GFP11), y mostramos cómo podría usarse para investigar la biología de la malaria en etapa hepática.
Introduction
A pesar de los avances en el desarrollo de medicamentos y la investigación sobre la prevención y el tratamiento del paludismo, la carga mundial de morbilidad del paludismo sigue siendo alta. Más de medio millón de personas mueren de malaria cada año, y los niveles más altos de mortalidad se observan entre los niños que viven en regiones donde la malaria es endémica, como el África subsahariana1. La malaria es causada por el parásito Plasmodium, que se transmite a los humanos a través de la picadura de mosquitos Anopheles hembra que portan el parásito en sus glándulas salivales. La etapa infecciosa de Plasmodium, los esporozoítos, se depositan en la piel de los huéspedes vertebrados durante una ingesta de sangre y viajan a través del torrente sanguíneo para infectar las células hepáticas, donde experimentan un desarrollo obligatorio (constituyendo malaria preeritrocítica) antes de infectar a los eritrocitos. La infección de los eritrocitos inicia el estadio sanguíneo de la malaria y es responsable de la totalidad de la morbilidad y mortalidad asociada a la enfermedad 2,3.
La naturaleza obligada del desarrollo preeritrocitario de Plasmodium lo ha convertido en un objetivo atractivo para los esfuerzos de desarrollo de vacunas y fármacos profilácticos4. Un requisito previo para estudiar la biología de la malaria preeritrocítica, así como para el desarrollo de vacunas o fármacos dirigidos a la etapa hepática, es el acceso a los esporozoítos de Plasmodium. Además, nuestra capacidad para generar esporozoítos de Plasmodium modificados genéticamente ha sido fundamental para el éxito de tales esfuerzos de investigación 5,6,7,8,9. Las líneas transgénicas de Plasmodium que expresan proteínas reporteras fluorescentes o luminiscentes nos han permitido rastrear su desarrollo in vivo e in vitro10,11. Los parásitos genéticamente atenuados (GAPs, por sus siglas en inglés), generados a través de la deleción de múltiples genes en Plasmodium, son también algunos de los candidatos vacunales más prometedores12,13.
Los modelos de malaria en roedores y primates no humanos nos han ayudado a comprender los mecanismos de las interacciones huésped-parásito en la malaria humana debido a las similitudes en la biología y el ciclo de vida entre las especies de Plasmodium 14. El uso de especies de Plasmodium que infectan a los roedores, pero no a los humanos (por ejemplo, P. berghei) permite mantener el ciclo de vida completo del parásito y la generación de esporozoítos infecciosos para estudiar la malaria en etapa hepática en un entorno controlado de nivel 1 de bioseguridad. Ya existe una variedad de protocolos separados para la generación de parásitos transgénicos de Plasmodium en estadio sanguíneo 15, la infección de mosquitos16 y el aislamiento de esporozoítos17. Aquí, describimos un protocolo integral que combina estas metodologías para generar y aislar esporozoítos transgénicos de P. berghei, utilizando la nueva cepa transgénica PbGFP11 como ejemplo. PbGFP 11 transporta la 11ª cadena de β de la proteína fluorescente verde (GFP) de supercarpeta, GFP11, a la vacuola parasitófora (PV) generada en los hepatocitos del huésped. La PbGFP11 se utiliza junto con hepatocitos transgénicos (Hepa1-6 de fondo) que expresan residuos que constituyen el fragmento de GFP 1-10 (GFP 1-10) en el citoplasma (células Hepa GFP 1-10). La PbGFP11 reporta la lisis de PV en los hepatocitos del huésped a través de la autocomplementación y la reformación de la GFP funcional y la señal de fluorescencia verde18. Cabe destacar que GFP 11 se codifica como una serie de siete secuencias en tándem en PbGFP11 para mejorar la señal de fluorescencia resultante. Al teñir los esporozoítos de PbGFP11 con el colorante citoplasmático CellTrace Violet (CTV), podemos rastrear los parásitos. La lisis de estos parásitos intracelulares teñidos con CTV da lugar a la fuga de CTV en el citoplasma de la célula huésped y a la tinción de la célula huésped. Además de visualizar y distinguir la lisis de Plasmodium PV y/o del parásito en los hepatocitos del huésped, este sistema puede utilizarse de forma fiable para estudiar las vías inmunes responsables de cualquiera de estos procesos, a través de la perturbación genética o terapéutica de los componentes moleculares de dichas vías.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos utilizado el protocolo anterior en nuestro laboratorio para crear varias líneas de parásitos transgénicos de P. berghei. Aunque optimizado para P. berghei, también hemos utilizado con éxito este protocolo para generar esporozoítos transgénicos de P. yoelii. Después de inyectar los esquizontes transfectados en ratones, los parásitos son detectables típicamente a más tardar 3 d.p.i. en todos los grupos, incluido el control sin plásmido. La selección se inicia solo una vez que s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud AI168307 a SPK. Agradecemos al núcleo de citometría de flujo CTEGD de la UGA y al núcleo de microscopía CTEGD de la UGA. También reconocemos las contribuciones de Ash Pathak, Anne Elliot y el personal de UGA Sporocore en la optimización del protocolo. Queremos agradecer al Dr. Daichi Kamiyama por sus valiosas ideas, discusiones y los plásmidos padres que contienen GFP11 y GFP 1-10. También nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Kurup por su constante apoyo, paciencia y aliento.
Materials
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II – Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
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