توليد المتصورة المعدلة وراثيا بيرغي سبوروزويتات
Summary
تنتقل الملاريا عن طريق تلقيح مرحلة sporozoite من البلازموديوم بواسطة البعوض المصاب. لقد سمحت لنا البلازموديوم المعدلة وراثيا بفهم بيولوجيا الملاريا بشكل أفضل وساهمت بشكل مباشر في جهود تطوير لقاح الملاريا. هنا ، نصف منهجية مبسطة لتوليد المتصورة المعدلة وراثيا Sporozoites المعدلة وراثيا.
Abstract
الملاريا مرض قاتل يسببه طفيلي البلازموديوم وينتقل عن طريق لدغة أنثى بعوض الأنوفيلة . تخضع مرحلة sporozoite من Plasmodium التي يرسبها البعوض في جلد مضيفات الفقاريات لمرحلة من التطور الإلزامي في الكبد قبل بدء الملاريا السريرية. نحن نعرف القليل عن بيولوجيا تطور البلازموديوم في الكبد. يعد الوصول إلى مرحلة sporozoite والقدرة على تعديل هذه الأسبوروزويتات وراثيا من الأدوات الحاسمة لدراسة طبيعة عدوى المتصورة والاستجابة المناعية الناتجة في الكبد. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتوليد المتصورة المعدلة وراثيا Sporozoites المعدلة وراثيا. نقوم بتعديل مرحلة الدم وراثيا P. berghei ونستخدم هذا النموذج لإصابة بعوض الأنوفيليس عندما يتناولون وجبة دم. بعد أن تخضع الطفيليات المعدلة وراثيا للتطور في البعوض ، نقوم بعزل مرحلة sporozoite من الطفيلي من الغدد اللعابية للبعوض لإجراء تجارب في الجسم الحي وفي المختبر . لقد أثبتنا صحة البروتوكول من خلال توليد sporozoites من سلالة جديدة من P. berghei تعبر عن الوحدة الفرعية 11 من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) (GFP11) ، ونوضح كيف يمكن استخدامها للتحقيق في بيولوجيا الملاريا في مرحلة الكبد.
Introduction
وعلى الرغم من التقدم المحرز في تطوير الأدوية والبحوث في مجال الوقاية من الملاريا وعلاجها، لا يزال عبء الملاريا العالمي مرتفعا. يموت أكثر من نصف مليون شخص بسبب الملاريا كل عام، مع أعلى مستويات الوفيات بين الأطفال الذين يعيشون في المناطق الموبوءة بالملاريا، مثل أفريقيا جنوب الصحراءالكبرى 1. تحدث الملاريا بسبب طفيلي البلازموديوم ، الذي ينتقل إلى البشر من خلال لدغة أنثى بعوض الأنوفيليس التي تحمل الطفيلي في الغدد اللعابية. تترسب المرحلة المعدية من المتصورة – sporozoites – في جلد مضيفات الفقاريات أثناء تناول وجبة الدم وتنتقل عبر مجرى الدم لإصابة خلايا الكبد ، حيث تخضع لتطور إلزامي (تشكل الملاريا قبل كرات الدم الحمراء) قبل إصابة كريات الدم الحمراء. تبدأ عدوى كريات الدم الحمراء مرحلة الدم من الملاريا وهي مسؤولة عن مجمل المراضة والوفيات المرتبطة بالمرض 2,3.
جعلت الطبيعة الإلزامية لتطور البلازموديوم قبل كريات الدم الحمراء هدفا جذابا لجهود تطوير اللقاح والأدويةالوقائية 4. شرط أساسي لدراسة بيولوجيا الملاريا قبل كريات الدم الحمراء ، وكذلك تطوير اللقاحات أو الأدوية التي تستهدف مرحلة الكبد ، هو الوصول إلى Plasmodium sporozoites. علاوة على ذلك ، كانت قدرتنا على توليد Plasmodium sporozoites المعدلة وراثيا مفيدة في نجاح هذه المساعي البحثية5،6،7،8،9. سمحت لنا خطوط البلازموديوم المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتينات مراسل الفلورسنت أو الإنارة بتتبع تطورها في الجسم الحي وفي المختبر10,11. الطفيليات الموهنة وراثيا (GAPs) ، الناتجة عن حذف جينات متعددة في البلازموديوم ، هي أيضا بعض من أكثر اللقاحات الواعدةالمرشحة 12,13.
ساعدتنا نماذج ملاريا الرئيسيات القوارض وغير البشرية على فهم آليات التفاعلات بين الطفيليات المضيفة في الملاريا البشرية بسبب أوجه التشابه في علم الأحياء ودورة الحياة بين أنواع المتصورة 14. يسمح استخدام أنواع البلازموديوم التي تصيب القوارض ، ولكن ليس البشر (على سبيل المثال ، P. berghei) بالحفاظ على دورة حياة الطفيليات الكاملة وتوليد sporozoites المعدية لدراسة الملاريا في مرحلة الكبد في بيئة خاضعة للرقابة من مستوى السلامة البيولوجية 1. توجد بالفعل مجموعة متنوعة من البروتوكولات المنفصلة لتوليد طفيليات البلازموديوم في مرحلة الدم المعدلة وراثيا 15 ، وعدوى البعوض16 ، وعزل sporozoites17. هنا ، نحدد بروتوكولا شاملا يجمع بين هذه المنهجيات من أجل توليد وعزل P. berghei sporozoites المعدلة وراثيا ، باستخدام السلالة المعدلة وراثيا الجديدة PbGFP11 كمثال. يتاجر PbGFP 11 بالشريط الحادي عشر β من بروتين الفلورسنت الأخضر فائق المجلد (GFP) ، GFP11 ، في الفجوة الطفيلية (PV) المتولدة في خلايا الكبد المضيفة. يستخدم PbGFP 11 جنبا إلى جنب مع خلايا الكبد المعدلة وراثيا (خلفية Hepa1-6) التي تعبر عن المخلفات التي تشكل جزء GFP 1-10 (GFP 1-10) في السيتوبلازم (خلايا Hepa GFP 1-10). يبلغ PbGFP11 عن تحلل PV في خلايا الكبد المضيفة من خلال التكامل الذاتي وإصلاح GFP الوظيفي وإشارة التألق الخضراء18. وتجدر الإشارة إلى أن GFP 11 مشفر كسلسلة من سبعة تسلسلات ترادفية في PbGFP11 لتعزيز إشارة التألق الناتجة. عند تلطيخ PbGFP11 sporozoites مع صبغة السيتوبلازم CellTrace Violet (CTV) ، يمكننا تتبع الطفيليات. يؤدي تحلل هذه الطفيليات داخل الخلايا الملطخة ب CTV نفسها إلى تسرب CTV إلى سيتوبلازم الخلية المضيفة وتلطيخ الخلية المضيفة. بالإضافة إلى تصور وتمييز تحلل Plasmodium PV و / أو الطفيلي في خلايا الكبد المضيفة ، يمكن استخدام هذا النظام بشكل موثوق لدراسة المسارات المناعية المسؤولة عن أي من هذه العمليات ، من خلال الاضطراب الجيني أو العلاجي للمكونات الجزيئية لهذه المسارات.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد استخدمنا البروتوكول أعلاه في مختبرنا لإنشاء عدة خطوط من طفيليات P. berghei المعدلة وراثيا. على الرغم من أنه تم تحسينه ل P. berghei ، فقد استخدمنا هذا البروتوكول بنجاح لتوليد P. yoelii sporozoites المعدلة وراثيا. بعد حقن الفصاميات المنقولة في الفئران ، يمكن اكتشاف الطفيليات عادة في موعد لا …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة AI168307 إلى SPK. نشكر نواة قياس التدفق الخلوي UGA CTEGD ونواة الفحص المجهري UGA CTEGD. كما نعترف بمساهمات آش باثاك وآن إليوت وموظفي UGA Sporocore في تحسين البروتوكول. نود أن نشكر الدكتور دايتشي كامياما على الأفكار القيمة والمناقشة والبلازميدات الأم التي تحتوي على GFP11 و GFP 1-10. نود أيضا أن نشكر أعضاء مختبر Kurup على دعمهم المستمر وصبرهم وتشجيعهم.
Materials
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II – Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
References
- WHO. Geneva. World Health Organization. , 1 (2020).
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
- Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
- Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400 (2020).
- Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
- Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
- Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
- Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
- Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
- Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
- Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
- Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
- Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
- Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
- Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
- Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
- de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
- Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
- Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
- Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487 (2022).
- Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).
