Análise da Síntese Lipídica Neutra em Saccharomyces cerevisiae por Rotulagem Metabólica e Cromatografia de Camada Fina

Acetil-CoA é o bloco fundamental de construção de diversas biomoléculas, incluindo lipídios neutros (NLs), que servem como uma moeda biomolecular versátil para a construção de membranas, geração de ATP e regulação da sinalização celular^1,2. A disponibilidade de NLs a serem desviados para qualquer uma dessas respectivas vias é, em parte, regulada pelo seu armazenamento. Gotículas lipídicas (LDs), organelas citoplasmáticas compostas de núcleos hidrofóbicos de triglicérides (TGs) e esterol-ésteres (SEs), são os principais compartimentos de armazenamento da maioria dos NLs celulares. Sendo assim, os LDs sequeram e regulam as NLs, que podem ser degradadas e posteriormente utilizadas para processos bioquímicos e metabólicos^3,4. Sabe-se que a má regulação das proteínas associadas à NL e LD está correlacionada com o surgimento de patologias, incluindo lipodistrofia e síndromes metabólicas^5,6. Por causa disso, a pesquisa atual de LD está intensamente focada em como a síntese de NL é regulada espacialmente, temporalmente e através de tecidos distintos de organismos multicelulares. Devido aos papéis celulares onipresentes para as NLs, muitas enzimas responsáveis pela síntese e regulação das NLs são conservadas ao longo dos eucariotes⁷. De fato, até alguns procariotes armazenam NLs em LDs⁸. Portanto, organismos modelos geneticamente tratáveis, como saccharomyces cerevisiae (levedura brotante) têm sido úteis para o estudo da síntese e regulação da NL.

A separação e quantificação dos NLs dos extratos celulares pode ser realizada de uma infinidade de formas, incluindo espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e espectrometria de massa líquida de ultra-desempenho (UPLC-MS)^9,10,11. Talvez o método mais simples para separar NLs seja através da cromatografia de camada fina (TLC), que permite quantificação densitométrica subsequente a partir de uma curva padrão^12,13. Embora o TLC forneça apenas uma separação de NLs em termos de curso, ela continua sendo uma técnica poderosa porque é barata, e permite a rápida separação de NLs de várias amostras simultaneamente. Dois dos desafios mais consideráveis enfrentados pelo estudo dos NLs via TLC são: 1) a ampla gama de abundâncias celulares de espécies NL e seus intermediários, e 2) a faixa de hidrofilicidade/hidrofobiidade de intermediários lipídicos dentro das vias de síntese da NL. Consequentemente, a quantificação das espécies de NL via TLC é tipicamente restrita às espécies mais abundantes; no entanto, a introdução de um rádio de ácido ¹⁴C-acético pode aumentar significativamente a detecção de intermediários de baixa abundância dentro de vias NL. O ácido acético é rapidamente convertido em acetil-CoA pelo acetil-CoA synthetase ACS2¹⁴, que faz do ácido ^{acético 14}C um substrato de radiolabeling adequado na levedura¹⁵. Além disso, a separação tanto de NLs hidrofóbicos quanto de intermediários hidrofílicos de NLs pode ser alcançada pela TLC através do uso de múltiplos sistemas de solventes¹⁶. Aqui, é apresentado um método para a separação de NLs usando rotulagem metabólica de ácido acético ^{de 14}C na levedura. Os lipídios rotulados durante o período de pulso são posteriormente isolados por um protocolo de isolamento lipíduo total bem estabelecido^17,seguido pela separação de espécies NL por TLC. O desenvolvimento de placas TLC tanto pela autoradiografia para visualizar lipídios rotulados, quanto um spray químico para visualizar lipídios totais, permite múltiplos métodos de quantificação. Bandas lipídicas individuais também podem ser facilmente extraídas da placa TLC usando uma lâmina de barbear, e a contagem de cintilação pode ser usada para quantificar a quantidade de material radiolabeled dentro da banda.