대사 라벨링 및 얇은 층 크로마토그래피에 의한 사카로미세스 세레시아의 중립 지질 합성 분석
Summary
여기서, 중성 지질의 분리를 위한 얇은 층 크로마토그래피와 결합된 14C-아세트산을 가진 효모의 대사 라벨링을 위한 프로토콜이 제시된다.
Abstract
중성 지질 (LL)은 에너지와 지질 항상성에 중요한 역할을하는 소수성, 불책임한 생체 분자의 클래스입니다. LLs는 아세틸-CoA로부터 합성드 노보이며 트리글리세라이드(TGs) 및 스테롤 에스테르(SEs)의 형태로 주로 진핵생물에 존재한다. LL의 합성을 담당하는 효소는 Saccharomyces cerevisiae (효모)에서 인간에게 매우 보존되어 효모는 NL 신진 대사 효소의 기능과 조절을 해부하는 유용한 모델 유기체입니다. 아세틸-CoA가 다양한 NL 종으로 변환되는 방법에 대해 많은 알려져 있지만, NL 대사 효소를 조절하기 위한 메커니즘, 그리고 잘못된 규제가 세포 병리학에 어떻게 기여할 수 있는지에 대해서는 여전히 발견되고 있습니다. NL 종의 고립과 특성화를 위한 수많은 방법은 수십 년 동안 연구를 통해 개발되고 사용되었습니다. 그러나 주요 NL 종의 포괄적인 특성화를 위한 정량적이고 단순한 프로토콜은 논의되지 않았습니다. 여기서, 효모에서 주요 NL 종의 드 노보 합성을 정량화하는 간단하고 적응 가능한 방법이 제시된다. 우리는 얇은 층 크로마토그래피와 결합 된 14C-아세트산 대사 라벨링을 적용하여 다양한 생리학적으로 중요한 LL을 분리하고 정량화합니다.
Introduction
아세틸-코아는 중성 지질(LL)을 포함한 다양한 생체분자의 기본 구성 블록으로, 멤브레인 을 구축하고 ATP를 생성하며 세포 신호1,2를조절하는 다목적 생체 분자 통화로 작용한다. 이러한 각 경로 중 어느 경로로든 LS를 회피할 수 있는 가용성은 부분적으로 스토리지에 의해 규제됩니다. 지질 방울(LDs), 트리글리세라이드(TGs) 및 스테롤 에스테르(SEs)의 소수성 코어로 구성된 세포질 세포기관은 대부분의 셀룰러 LL의 주요 저장 칸입니다. 이와 같이, LDs 격리 및 조절 LL, 이는 저하 될 수 있으며, 그 후 생화학 및 신진 대사과정에활용3,4. NL 및 LD 관련 단백질의 잘못된 조절은 lipodystrophy 및 대사 증후군5,6을포함하여 병리학의 개시와 상관관계가 있는 것으로 알려져 있습니다. 이 때문에, 현재 LD 연구는 NL 합성이 공간적으로, 현세적으로, 그리고 다세포 유기체의 뚜렷한 조직에 걸쳐 어떻게 규제되는지에 집중됩니다. LL에 대한 유비쿼터스 세포 역할로 인해 LL의 합성 및 조절을 담당하는 많은 효소가 진핵생물7을통해 보존됩니다. 실제로 일부 prokaryotes도 LDS8에L을 저장합니다. 따라서, Saccharomyces cerevisiae (신진 효모)와 같은 유전적 인 기관체는 NL 합성 및 조절의 연구에 유용했습니다.
세포 추출물로부터의 LL의 분리 및 정량화는 가스 크로마토그래피 질량 분석법(GC-MS), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 초고성능 액체 크로마토그래피 질량 분석법(UPLC-MS)9,10,11을포함한 무수한 방법으로 달성될 수 있다. 아마도 LL을 분리하는 가장 간단한 방법은 표준곡선(12,13)에서후속 밀도 정량화를 허용하는 얇은 층 크로마토그래피(TLC)를 통해서일 수 있다. TLC는 L의 코스 그레인 분리만 제공하지만 저렴하기 때문에 강력한 기술로 남아 있으며 여러 샘플에서 동시에 L을 신속하게 분리할 수 있습니다. TLC를 통해 LL의 연구에 직면 하는 가장 상당한 과제의 두 가지는: 1) NL 종 및 그들의 중간체의 세포 풍부의 광범위 한 범위, 그리고 2) NL 합성 경로 내에서 지질 중간체의 소수성/소수성의 범위. 따라서, TLC를 통해 NL 종의 정량화는 일반적으로 가장 풍부한 종으로 제한됩니다; 그러나, 14C-아세트산 방사성 라벨의 도입은 NL 경로 내에서 낮은 풍부 중간체의 검출을 크게 향상시킬 수 있습니다. 아세트산은 아세틸-코아 시냅스 ACS214에의해 아세틸-코아로 빠르게 변환되어, 이는 14C-아세트산을 효모15에서적합한 방사성 라벨기질로 만든다. 또한, 다수의 용매시스템(16)을사용하여 TLC에 의해 소수성 LL 및 LL의 친성 중급자 모두의 분리를 달성할 수 있다. 여기서, 효모에서 14C-아세트산 대사 라벨링을 사용하여 LL의 분리를 위한 방법이 제시된다. 펄스 기간 동안 표지된 지질은 그 후 잘 확립된 총 지질 격리프로토콜(17)에의해 격리되고, 그 다음으로 TLC에 의한 NL 종의 분리가 뒤따릅니다. 라벨이 부착된 지질을 시각화하기 위해 사인 방사선 촬영으로 TLC 플레이트를 개발하고 총 지질을 시각화하는 화학 스프레이를 개발하여 여러 가지 정량화 방법을 허용합니다. 개별 지질 밴드는 또한 면도날을 사용하여 TLC 플레이트에서 쉽게 추출할 수 있으며, 신경화 계수는 밴드 내의 방사성 라벨 재료의 양을 정량화하는 데 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, 효모에서 NL 종의 합성을 정량적으로 모니터링하는 다목적 방사성 라벨링 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 매우 모듈식이므로 3-6 일 이내에 절차를 완료 할 수 있습니다. 또한, TLC 용매시스템(16,19)의간단한 변화와 함께 관심 있는 여러 지질 종을 검출할 수 있도록 하는 지질종과 대사산물을 분리하기 위해 TLC를 사용하는 데 많은문헌이존재?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이 연구의 완성에 도움이나 개념적 조언을 준 Henne 연구소의 회원들에게 감사를 표하고 싶습니다. W.M.H.는 웰치 재단(I-1873), NIH NIGMS(GM119768), 아라 파레스기 안의학 연구 기금, UT 남서부 인다우먼트 학자 프로그램의 기금으로 지원됩니다. S.R은 T32 프로그램 교부금(5T32GM0008297)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
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